王 琳，周立冬，劉謀元，劉理金，崔 輝，佟 巍，劉愛兵

化學消毒劑的使用歷史悠久，殺菌效果明顯，價格低廉，是臨床消毒工作的重要方法之一，在防病防災等領(lǐng)域已取得廣泛應用[1]；其主要作用是以一定的形式對病原微生物進行殺滅，從而阻斷微生物滋生條件及疾病傳播途徑[2]。目前，國內(nèi)外常用的化學消毒劑有：含氯化合物、氧化劑類、季銨鹽化合物、酚類化合物、醛類化合物、氧化電位水、醇類、銀和碘化合物類等。這些消毒劑作用于人體或環(huán)境、物體表面，起消毒滅菌的效果，但對人體及環(huán)境也會產(chǎn)生危害，某些危害嚴重的消毒劑已是目前禁止使用的產(chǎn)品。在災害救援領(lǐng)域，也存在消毒效力不足和過度消殺兩大弊端，故開發(fā)新型化學消毒劑以增強消毒效力、減少對人與環(huán)境的危害已刻不容緩。全新含氮消毒劑彌補了常規(guī)消毒劑的不足，更安全、環(huán)保，本實驗將對其殺菌效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 試劑：主要成分為醛類衍生物、季銨鹽、螯合劑、原料A的含氮消毒劑，中和劑，LEAGENE芽孢染色液，芽孢懸液，Ruitaibio營養(yǎng)瓊脂。儀器：上海森信恒溫培養(yǎng)箱DRP-9082、上海森信烤箱DGG-9140(A)、蘇州凈化超凈臺VS-1300L-U、吉爾森單道加樣槍G23、新華蒸汽滅菌器TMQ.C5070J。

1.2 方法

1.2.1 芽孢懸液的制備 第1天：（1）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制備。（2）接種芽孢菌：取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細吸管吸加適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5～10 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養(yǎng) 18～24 h。第2天：用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18～24 h。第3天：挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng) 18～24 h，即為第3代培養(yǎng)物。第4天：用10.0 ml吸管吸取5.0～10.0 ml 第3～5代的18～24 h營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面，將其搖動使菌液布滿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將羅氏瓶置于37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)5～7 d。1周后：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板養(yǎng)物，用10.0 ml 吸管加10.0 ml 無菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶內(nèi)吸加5.0 ml 無菌蒸餾水，重復洗菌一遍。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5 min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。

1.2.2 芽孢染色 （1）常規(guī)涂片。（2）滴加石炭酸復紅染色液于涂片上，緩慢加熱使染液冒蒸汽但不沸騰，并繼續(xù)滴加熱液不使涂片上的染液蒸干，維持5 min。（3）待涂片自然冷卻至室溫，傾去染液。用脫色液脫色至無紅色染液流出為止，水洗。（4）滴加堿性美藍染色液，復染2～3 min。（5）輕輕水洗。（6）用濾紙沿涂片邊緣吸干水分，鏡檢。成功制備芽孢懸液，石炭酸復紅染色顯示芽孢被染成紅色呈圓形或橢圓形小體，菌體藍色，見圖1。

圖1 芽孢顯色結(jié)果

1.2.3 中和劑和培養(yǎng)基的配制 （1）中和劑：0.3%硫代硫酸鈉、0.3%卵磷脂、0.5%吐溫、80的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic soy broth，TSB)，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)pH值約7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為（7.3±0.2），分裝備用。（2）培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（18 g/1000 ml），加熱煮沸，121℃高壓滅菌25 min，培養(yǎng)皿10 ml分裝備用。

1.2.4 消毒實驗 試驗組：（1）菌種準備，枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢；（2）制備濃度在1×105cfu/ml的枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢；（3）配置濃度為1%、2%、3%的含氮化合物消毒劑各12 ml為試驗組1、試驗組2、試驗組3，每組吸取4 ml與制備好的枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌懸液1.0 ml混合，迅速混勻并立即計時；（4）當溶液反應至預定時間后（10、20、30 min），分別吸取0.5 ml溶液加入到4.5 ml經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻；（5）涂板，畫線接種細菌。37℃，培養(yǎng)48 h。

對照組：（1）陽性對照用4.0 ml磷酸鹽緩沖液代替4.0 ml消毒劑與1.0 ml菌懸液反應，并取0.5 ml混合液與4.5 ml的中和劑反應，進行平行實驗，作為陽性對照。（2）陰性對照分別取此次實驗相關(guān)的溶液（即無菌純化水，磷酸鹽緩沖液，中和劑，培養(yǎng)基）各1.0 ml，分別與4.0 ml磷酸鹽緩沖液混勻，混勻后各取0.5 ml混合液與4.5 ml中和劑混合，進行平行試驗，作為陰性對照。

實驗完成后，所有實驗樣本送至化驗室37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)。平均滅活對數(shù)值的計算：設(shè)陽性對照組菌落數(shù)為No，試驗（消毒）組菌落數(shù)為Nx，平均滅活對數(shù)值=lg No-lg Nx。

2 結(jié) 果

2.1 消毒實驗 試驗組1、試驗組2、試驗組3分別與濃度為105cfu/ml的芽孢懸液作用10、20、30 min三個時間段，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h時菌落計數(shù)，見表1。

表1 瓊脂板芽孢菌落計數(shù)結(jié)果

2.2 試驗組平均滅活對數(shù)值 殺滅對數(shù)值就是指當微生物數(shù)量以10為底的對數(shù)表示時，滅菌前后微生物對數(shù)數(shù)量的差值[3]。平均滅活對數(shù)值 = lg No－lg Nx 計算結(jié)果顯示,與對照組比較，3種濃度消毒劑均有殺死芽孢的作用，并且隨著消毒劑濃度的增加，殺菌時間縮短。1%濃度消毒劑隨著作用時間延長，殺菌能力增強；而2%濃度的消毒劑作用30 min，3%濃度的消毒劑作用20 min，對枯草桿菌黑色變種芽孢的清除率均達到100%。見表2。

表2 試驗組不同濃度消毒劑平均滅活對數(shù)值計算結(jié)果

3 討 論

消毒劑是指用于殺滅傳播媒介上病原微生物，使其達到消毒或滅菌效果且無害化要求的制劑[4]，消毒是預防和控制傳染病流行的重要措施和手段，正確掌握消毒知識，提高對消毒工作的意識和重視程度，規(guī)范正確的行為對于預防和降低傳染性疾病的發(fā)生具有積極而長遠的意義[5]。國際消毒行業(yè)優(yōu)秀消毒劑應體現(xiàn)在，（1）安全：對人無害（無生物毒性） （LC50、LD50濃度很高）。（2）環(huán)保：對生產(chǎn)環(huán)境無污染（材質(zhì)無腐蝕性）；分解產(chǎn)物無有害物質(zhì)殘留，對生態(tài)環(huán)境無害。（3）殺毒機理確切：復配技術(shù)已成為重要研究方向，復方消毒劑克服了單一消毒劑單獨使用時的缺點，增加了殺菌作用。（4）殺毒效能高：高效，滅菌能力強，作用時間快。近年來，地震、洪澇等自然災害頻發(fā)[6]，研發(fā)無毒、環(huán)保的化學消毒劑在災害救援醫(yī)學領(lǐng)域具有重要科學意義和應用價值，同時，在日常醫(yī)療體系及民用市場領(lǐng)域也有重要的社會、經(jīng)濟效益。

本實驗所用含氮消毒劑的主要成分有醛類衍生物、季銨鹽等，其符合湖南省疾控中心殺菌譜-高效廣譜以及衛(wèi)生部安全、環(huán)保標準。季銨鹽屬陽離子表面活性劑，其殺菌機理主要是通過在水中形成帶正電荷的物質(zhì)，吸附于帶負電荷的微生物表面，形成微團，通過滲透作用進入細胞膜的類脂層，改變膜的滲透性，當季銨鹽濃度足夠高時，胞膜非雙層結(jié)構(gòu)的形成可導致細胞膜的破裂和細胞內(nèi)容物的滲漏[7]，阻斷細菌或病毒DNA復制，完成滅菌。

影響消毒劑作用效果的因素有很多，其中，消毒劑濃度的影響至關(guān)重要[8]。本實驗研究顯示，與對照組比較，3種濃度消毒劑均有殺死芽孢的作用，并且隨著消毒劑濃度的增加，殺菌時間縮短。1%濃度消毒劑隨著作用時間延長，殺菌能力增強；而2%濃度的消毒劑作用30 min，3%濃度的消毒劑作用20 min，對枯草桿菌黑色變種芽孢的清除率均達到100%。

本實驗結(jié)果表明，3%濃度消毒劑可以在較短時間內(nèi)殺死枯草芽孢桿菌，適用于需要快速高效殺毒的場所或情景。地震、泥石流、洪澇等重大災害發(fā)生時，不僅嚴重影響廣大人民群眾的生命財產(chǎn)安全，還會導致環(huán)境污染、傳染病疫情等次生災害。因此，在災害發(fā)生后可使用3%濃度的消毒劑對災害現(xiàn)場進行全面消殺，及時防止疫情的發(fā)生，并保障救災工作的順利開展。1%濃度的消毒劑能在30 min內(nèi)將枯草芽孢桿菌全部殺死，因而可將其廣泛應用于物體浸泡消毒、家庭保潔、園林防病治病等領(lǐng)域。

本實驗中全新含氮消毒劑可對枯草桿菌黑色變種芽孢產(chǎn)生高效清除能力，但其對其他微生物是否同樣具備殺滅效果還有待進一步研究。

[1]肖佳慶，李 俐，高珉之，等. 兩種含氯消毒劑對枯草桿菌黑色變種芽孢殺滅效果及相關(guān)性能的實驗觀察[J]. 醫(yī)學動物防制，2015，31（6）: 626-630.

[2]劉繼敏，高貴軍. 消毒劑的應用與發(fā)展前景探討[J]. 醫(yī)學動物防制，2014，30（12）:1353-1356.

[3]薛廣波. 微生物消毒技術(shù)規(guī)范[M]. 北京：中國標準出版社，2010: 3-5.

[4]萬新祥，曾凡林，楊 芳. 消毒劑的種類與應用[J].第一軍醫(yī)大學分校學報，2006，26（1）: 74-76.

[5]秦 迪，劉愛萍，申同洋，等. 社區(qū)居民消毒知識、態(tài)度及行為調(diào)查[J].中國公共衛(wèi)生，2013，29（11）: 1644-1646.

[6]任 凱，解 猛，姜文漢，等. 常用化學消毒劑的作用機理[J]. 中國衛(wèi)生工程學，2003，3（1）: 55-56.

[7]任 哲,饒 林,蔣 莉,等. 兩種季銨鹽消毒劑殺菌效果比較研究[J]. 中國消毒學雜志，2011，28（1）: 7-9.

[8]陳昭斌. 高度重視使用中消毒劑的有效濃度[J]. 中國公共衛(wèi)生管理，2003，19（1）: 83-84.