徐 煜，任 婧

(光明乳業(yè)股份有限公司研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海 200436)

原料乳中嗜冷假單胞菌危害及控制研究進展

徐 煜，任 婧*

(光明乳業(yè)股份有限公司研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海 200436)

假單胞菌是對原料乳危害最大的嗜冷菌之一,極易在冷藏條件下成為優(yōu)勢菌群。大多數(shù)嗜冷假單胞菌有分泌蛋白酶和脂肪酶的能力，并導致原料乳及產(chǎn)品變質(zhì)。本文對原料乳假單胞菌的危害特點，快速檢測和新型控制工藝研究進展進行綜述。最后探討了嗜冷假單胞菌的研究方向。

嗜冷假單胞菌，危害，檢測，控制

嗜冷菌是影響原料乳及其制品質(zhì)量和安全的關(guān)鍵微生物。嗜冷菌在生長代謝過程中，分泌的耐熱性蛋白酶和脂酶，導致原料乳在高溫滅菌后凝膠、沉淀、變苦和酸敗[1]。同時，蛋白酶還會影響原料乳發(fā)酵，造成產(chǎn)品口感和風味缺陷[2-3]。一些嗜冷菌具有潛在致病性[4-5]，影響了原料乳的安全。假單胞菌是原料乳及其制品中常見的主要污染菌，同時是對原料乳危害最大的嗜冷菌之一[6]。因此，對假單胞菌危害特點，危害機制以及檢測控制方法的研究，對控制原料乳中嗜冷菌的危害，保障乳品安全有重要意義。本綜述對嗜冷假單胞菌危害性及檢測和控制工藝的研究進展進行綜述。

1 原料乳中嗜冷假單胞菌的危害

嗜冷假單胞菌對原料乳的危害體現(xiàn)在兩個方面:首先，假單胞菌在原料乳冷藏過程中，生長繁殖造成菌體數(shù)超標。假單胞菌對溫度變化適應力強，在7、22和30℃都能正常生長[7]，特別是在原料乳低溫冷藏或運輸過程中，嗜冷假單胞菌選擇性生長，往往成為許多國家和地區(qū)原料乳中主要污染微生物[4,8-11]。假單胞菌在自然界中廣泛存在，極易對原料乳生產(chǎn)鏈造成污染[10]，不僅對原料乳的收集，運輸和冷藏等各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)造成初次污染，而且還容易再次污染巴氏滅菌后的原料乳[8]。另一方面，嗜冷假單胞菌分泌的蛋白酶和脂肪酶會導致原料乳變質(zhì)[2]。嗜冷假單胞菌分泌蛋白酶，降解原料乳中的酪蛋白，產(chǎn)生疏水性多肽，會導致原料乳發(fā)苦。而嗜冷菌分泌的脂肪酶，降解原料乳中的脂肪，產(chǎn)生游離脂肪酸，會導致原料乳酸敗。這些蛋白酶和脂肪酶往往具有耐熱性，能在原料乳巴氏殺菌處理后仍然保持相當活性，進而影響乳產(chǎn)品貨架期[1-2]。

1.1 嗜冷假單胞菌在原料乳生產(chǎn)中的危害

影響原料乳中嗜冷假單胞菌生長繁殖能力的因素有很多，在不同條件下，嗜冷假單胞菌對原料乳的危害大小也不同。這些條件包括:氣候條件、原料乳含氧量和pH，原料乳的疏水性變化以及不同滅菌工藝對原料乳的處理。

研究表明，假單胞菌在原料乳中的出現(xiàn)頻率有一定的季節(jié)性。原料乳中假單胞菌在春天和秋天出現(xiàn)頻率更高[12]，危害風險更大。而在冬天，假單胞菌出現(xiàn)頻率相對較低，冬天出現(xiàn)頻率最高的是嗜溫菌，其原因可能是嗜溫菌對假單胞菌的生長有競爭抑制作用。

原料乳的含氧量和pH，對嗜冷假單胞菌的生長和蛋白酶、脂肪酶的分泌有重要影響。研究表明，降低原料乳含氧量和pH能抑制嗜冷假單胞菌的生長。在貯存階段，向原料乳中充入氮氣(N2)排出溶解氧，能抑制原料乳中嗜冷假單胞菌的生長[13]。但是這種處理方式對于嗜冷假單胞菌的抑制效果不如用二氧化碳(CO2)處理。向原料乳中充入CO2處理不僅能降低原料乳的含氧量，還能降低原料乳的pH，能更好地抑制嗜冷假單胞菌的生長以及蛋白酶、脂肪酶的分泌，并延長產(chǎn)品的貨架期[14]。但是CO2處理引起的原料乳pH下降，會造成一定的鈣和脂肪的減少。

原料乳在加工過程中自身疏水性的變化，能影響嗜冷假單胞菌的數(shù)量分布。在奶酪加工的過程中，隨著奶油的分離，在脫脂原料乳中未檢測到假單胞菌，假單胞菌對脫脂原料乳危害風險最小[3]。而假單胞菌主要出現(xiàn)在奶油中(所占嗜冷菌比例可以達到33%)，是其中主要的嗜冷菌，對奶油危害風險最大。造成這種分布比率差異的原因，可能是假單胞菌細胞表面的疏水性較強，對奶油的親和性較強，更傾向分布于奶油中。

不同滅菌工藝處理對原料乳中假單胞菌控制效果也大不相同。加熱的滅菌工藝對嗜冷假單胞菌數(shù)量控制效果最好。Rasolofo[15]的研究表明，二氧化碳處理以及微孔過濾處理的原料乳在4℃冷藏的第7d時，假單胞菌分別占嗜冷菌總數(shù)的56.6%和55.6%。而在加熱處理的原料乳中，假單胞菌僅占0.6%。然而巴氏消毒以及超高溫瞬時處理(UHT)等加熱的殺菌技術(shù)，會不可避免地帶來原料乳營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)的破壞。

1.2 嗜冷假單胞菌不同種類的危害性

嗜冷菌分泌蛋白酶，脂肪酶和卵磷脂酶的能力，是對其危害性評價主要指標。嗜冷假單胞菌分泌這三種酶的能力差異很大，這些差異性不僅存在于不同種的假單胞菌之間，也存在于同種不同變型的假單胞菌之間。

假單胞菌種類眾多，原料乳中常見的嗜冷假單胞菌包括熒光假單胞菌(P.fluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)、莓實假單胞菌(P.fragi)、腐爛假單胞菌(P.putrefaciens)、海雀假單胞菌(P.lundensis)以及不常見的銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)[4,7]。不同假單胞菌分泌酶根據(jù)rRNA-DNA型雜交不同，分為5個rRNA類，真正的假單胞菌被限定在第一個rRNA類[16]，這類包括熒光假單胞菌和非熒光假單胞菌[17]。

大部分惡臭假單胞菌沒有明顯的蛋白酶、脂肪酶和卵磷脂酶的產(chǎn)酶活力[9,18]，對原料乳的危害較小。海雀假單胞菌和莓實假單胞菌能產(chǎn)生蛋白酶，會成為原料乳冷藏過程中的主要嗜冷菌群，對原料乳的危害較大[17-18]。熒光假單胞菌在原料乳中發(fā)現(xiàn)的頻率最高，是原料乳冷藏過程中常見的主要嗜冷菌群[19-20]。69%的熒光假單胞菌同時具有脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性[18]，對原料乳的降解速率也最高,是危害潛力最大的假單胞菌[7,17]，也是引起乳品變質(zhì)的最常見微生物[18]。

并不是所有的熒光假單胞菌都對原料乳有破壞性影響。熒光假單胞菌根據(jù)表型特征分為5個生物變型[17]。不同變型對原料乳的危害是不同的，有的變型同時產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶，嚴重危害原料乳品質(zhì)[7]，有的變型分泌的蛋白酶對原料乳變質(zhì)影響不大[10]，有的熒光假單胞菌卻能在原料乳加工過程中加速奶酪成熟[21]。這些熒光假單胞菌生物變型之間的基因差異以及表型差異小，很難區(qū)分。因此，建立亞種水平上的鑒別方法，對原料乳中熒光假單胞菌的危害性評估非常重要[10]。

1.3 嗜冷假單胞菌分泌的蛋白酶

嗜冷菌分泌的蛋白酶，根據(jù)催化機理分為四種[1]:絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶。它們往往能降解原料乳中的酪蛋白，導致原料乳變苦和凝膠并影響奶酪發(fā)酵[22]。嗜冷假單胞菌產(chǎn)蛋白酶能力強，分泌的蛋白酶主要為金屬蛋白酶，具有耐熱性，主要通過降解酪蛋白引起原料乳變質(zhì)。

大多數(shù)嗜冷假單胞菌產(chǎn)蛋白酶能力強。其產(chǎn)蛋白酶的溫度分布范圍廣泛，在15～30℃都產(chǎn)蛋白酶[3]。少數(shù)假單胞菌如莓實假單胞菌(P.fragi)在30℃不產(chǎn)蛋白酶。許多假單胞菌在原料乳中22℃生長兩天，就能產(chǎn)生至少一種耐熱的蛋白酶，這些蛋白分子量相似，在39.2～45.3ku之間[7]。假單胞菌產(chǎn)酶的能力和核糖核酸型有關(guān)，相同的核糖核酸型通常含有相同的胞外蛋白酶活、卵磷脂酶活和脂肪酸酶活[18]。

假單胞菌分泌的金屬蛋白酶，其活性中心金屬離子為鋅或鈣離子，催化最優(yōu)pH是6.5～8[1,7]。假單胞菌的蛋白酶具有耐熱性，在pH為7的緩沖液中，77℃加熱17s后仍然保持55%～65%的活性，140℃加熱5s后仍然保持20%～40%的活性[7]。

假單胞菌蛋白酶主要降解原料乳中的酪蛋白，對乳清蛋白的降解很少[17,23]。蛋白酶降解酪蛋白，會導致原料乳的物理化學性質(zhì)發(fā)生明顯變化，包括原料乳沉積，Zeta電勢和酪蛋白膠束水合作用降低，以及釋放出多肽[24]。假單胞菌蛋白酶對αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的降解能力是不同的，其中熒光假單胞菌蛋白酶對酪蛋白降解能力的大小順序是β-酪蛋白>αS1-酪蛋白>κ-酪蛋白=αS2-酪蛋白[25]。

熒光假單胞菌蛋白酶AprX的研究最深入。AprX蛋白屬于serralysin家族[26]，是耐熱蛋白酶，對四種酪蛋白都有降解作用。AprX對酪蛋白降解沒有特定的剪切位點，具有廣譜的催化活性。AprX對κ酪蛋白的降解是導致酪蛋白膠束水合能力以及zeta電勢下降的主要因素。當原料乳中AprX濃度達到0.2mg/L時，就會引發(fā)酪蛋白膠束的水解，在這個濃度下，只需要8d時間，就會導致UHT奶出現(xiàn)沉淀[25]。

2 原料乳中嗜冷假單胞菌的檢測

隨著乳品工業(yè)的發(fā)展，快速、靈敏并同時能評估嗜冷假單胞菌以及胞外酶的危害性，是對嗜冷假單胞菌檢測提出的新要求。

傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)分離方法，其優(yōu)點是能根據(jù)特征顏色反應直觀地鑒別微生物并反映活菌數(shù)[27]，然而檢測時間長，重復性低[28]。近些年，一些新型快速檢測方法，如實時定量PCR、環(huán)介導等溫擴增、熒光原位雜交、流式細胞技術(shù)、ATP生物發(fā)光技術(shù)[29]等技術(shù)已經(jīng)得到開發(fā)和應用。其中熒光原位雜交[30]、流式細胞等技術(shù)[31]能快速檢測嗜冷假單胞菌，并對活菌計數(shù)，可以達到和平板計數(shù)一致的結(jié)果。多重PCR結(jié)合微陣列熒光顯色方法，能快速檢測嗜冷假單胞菌的同時，還能同步檢測其他目標細菌[32]。然而由于并不是所有的嗜冷假單胞菌對原料乳都有破壞性影響，對其快速檢測并活菌計數(shù)不能反映嗜冷假單胞菌的真實危害性。

針對嗜冷假單胞菌危害性基因設(shè)計引物，運用隨機多樣性擴增PCR(Randomly amplified polymorphic DNA-PCR，RAPD-PCR)結(jié)合16S rRNA測序分析[4,10]可以對嗜冷假單胞菌進行快速檢測并反映其危害性。當前對嗜冷假單胞菌比較關(guān)注的危害性基因是堿性金屬蛋白酶基因apr(alkaline metalloprotease)[26]。其中堿性金屬蛋白酶基因aprX基因研究最多，aprX編碼的堿性金屬蛋白酶AprX，能降解酪蛋白引發(fā)原料乳變質(zhì)[25]。aprX作為標志性危害基因能檢測大部分的假單胞菌。如Marchand等人在調(diào)查的55種假單胞菌中，用aprX基因為PCR檢測引物，能檢測到42種[7]。然而，以aprX為標記基因檢測不出另一個重要的污染假單胞菌-海雀假單胞菌[7]。不過，另一個標記基因-氨甲酰磷酸合成酶基因carA可以檢測海雀假單胞菌，但是carA基因不適合檢測熒光假單胞菌[10]。因此，這兩個基因標記在嗜冷菌的檢測中可以互補使用。

aprX基因還存在于幾種嗜冷熒光假單胞菌中[17]，可以用于評估熒光假單胞菌的不同變型對原料乳的危害。由于基因aprX位于操縱子區(qū)域，負責編碼脂肪酶、蛋白酶阻抑物、蛋白酶分泌裝置(proteasesecretion apparatus)和轉(zhuǎn)運蛋白(autotransporter proteins)。這個操縱子在不同菌株間的組織結(jié)構(gòu)是不一樣的[17]。例如熒光假單胞菌F和CIP7325的基因結(jié)構(gòu)是aprX-inh-aprD-aprE-aprF；而只有熒光假單胞菌ATCC17400的結(jié)構(gòu)是aprX-inh。因此，對aprX基因的檢測不但可以評估熒光假單胞菌不同亞型的危害性，還可以用于解決熒光假單胞菌分型難題。

以基因aprX為標記基因，通過PCR和16S rRNA測序方法，檢測牛奶中的嗜冷菌，檢測速度快，信息全面，可以反映嗜冷假單胞菌的真實危害性，但是也有局限。比如，測序結(jié)果不能反映原料乳中的活菌數(shù)。此外，基因aprX的檢測并不能反映假單胞菌分泌蛋白酶AprX的水平。因為蛋白酶AprX產(chǎn)生水平和aprX基因的表達和調(diào)控有關(guān)，所以aprX基因的檢測還不能真正評估胞外蛋白酶對牛奶的腐敗危害[17]。

酶聯(lián)免疫法可以直接檢測牛奶中污染微生物胞外蛋白酶[33]。然而此方法的局限在于需要針對不同的蛋白酶制得對應的免疫蛋白，而且酶聯(lián)免疫的廣譜性不強，成本較高[7]。因此，開發(fā)快速、靈敏并同時能評估嗜冷假單胞菌以及胞外酶危害性的檢測方法，仍然需要進一步的研究。

3 原料乳中嗜冷假單胞菌的滅菌工藝

隨著消費需求的提升，消費者對牛乳營養(yǎng)品質(zhì)的要求也不斷提高。怎樣在有效殺滅致病菌和其他污染菌的同時，最大程度地保存原料乳中活性蛋白、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是新型殺菌工藝的研究方向。

傳統(tǒng)的殺菌工藝如低溫殺菌(60～66℃，5～20s)，巴氏殺菌(72℃,15s)和超高溫滅菌(如143℃，3s)等滅菌工藝能對嗜冷菌有效地殺滅和控制[21]，但是加熱工藝容易帶來原料乳活性營養(yǎng)成分的破壞。另外，添加過氧化物酶或者天然蛋白酶的抑制劑，加產(chǎn)細菌素的乳球菌和嗜熱乳酸桿菌，對原料乳充二氧化碳或氮氣等方法也能抑制嗜冷菌生長以及蛋白酶分泌[21,13-14]，但是這些方法并不能很好地殺滅和控制嗜冷菌。因此，新型非加熱處理工藝，如高壓脈沖電場(Pulsed Electric Fields，PEF)[34]，高強度光脈沖場(High Intensity Light Pulses，HILP)[35]，超聲技術(shù)[36]等成為關(guān)注的殺菌技術(shù)。

低溫加熱結(jié)合新型非加熱工藝的組合使用，以及運用合適的數(shù)學模型優(yōu)化滅菌條件是當前原料乳新型滅菌工藝的研究熱點。其中超聲技術(shù)和高壓脈沖電場已經(jīng)應用到原料乳中嗜冷假單胞菌的控制研究中。

壓力加熱超聲(Manothermosonication,MTS)可以對原料乳中的嗜冷熒光假單胞菌有較好的殺滅效果，在溫度(36℃)，聲強度(90W/cm2)，處理時間(240s)和恒定壓力(225kPa)下，可以將熒光假單胞菌(P.fluorescens)數(shù)量降低至1.6log CFU/mL。中心復合響應面模型(Central Composite Response Surface Model,ccRSM)分析表明MMTS對熒光假單胞菌(P.fluorescens)消滅效果是呈線性趨勢的，這個模型是預測MTS對生奶中常見微生物失活效果的良好方法[37]。

高壓脈沖電場(PEF)技術(shù)可以在低溫極短時間對熒光假單胞菌進行殺滅。在32.5℃,電場42.5kV/cm和處理時間106μs的條件下，就可以使熒光假單胞菌(P.fluorescens)數(shù)量下降105左右[38]。若繼續(xù)提高滅菌溫度，或者和超聲、高強度光脈沖場等技術(shù)聯(lián)用PEF還能夠達到更好的殺菌效果。PEF影響殺菌效果的主要因素是電場強度，高壓脈沖電場電穿孔作用能破壞各種微生物的細胞膜，這是其殺菌的主要原理。PEF能夠?qū)Ξa(chǎn)品批次處理或者連續(xù)處理。殺菌時間短，能廣譜性殺菌，而不會改變原料乳的風味和營養(yǎng)，是近幾年研究的熱點[39]。

目前還沒有高強度光脈沖場(HILP)對原料乳中假單胞菌滅菌效果的研究，但已有文章報道了HILP對原料乳中大腸桿菌和李斯特菌滅菌效果[35]。

除了物理電學的方法，微生物控制熒光假單胞菌的技術(shù)也在研究中。Monique R. Eller等[40]人嘗試用噬菌體控制控制食品中的熒光假單胞菌，從巴西乳品工業(yè)廢水中分離到熒光假單胞菌噬菌體，并得到完整的基因序列。為進一步研究打下了良好基礎(chǔ)。然而噬菌體對假單胞菌控制研究剛剛起步，同時噬菌體的使用安全性也需要進一步研究。

4 嗜冷假單胞菌研究展望

隨著基因和生物信息技術(shù)的進步，新型檢測方法對假單胞菌在原料乳生產(chǎn)、儲存和加工中的危害研究更加深入細致。開發(fā)快速、靈敏并同時能評估嗜冷假單胞菌以及胞外酶的危害性的檢測方法，仍然是需要解決的問題。特別是對熒光假單胞菌分型、鑒定并進行危害風險的評估，不僅需要尋找合適標記基因，更需要結(jié)合新型的快速檢測技術(shù)。

雖然新型非加熱殺菌工藝，能夠?qū)崿F(xiàn)在殺滅嗜冷假單胞菌及其他污染微生物的同時，最大程度地保留牛乳的營養(yǎng)和風味，但是這些新型工藝仍然處在實驗室研究階段，成本較高，需要新型的數(shù)學模型優(yōu)化工藝。因此，運用新的數(shù)學模型，優(yōu)化新型非加熱殺菌工藝，降低成本，并將這些工藝工業(yè)化，仍需深入研究。

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Research progress in hazards and control ofpsychrotrophilicPseudomonasin raw milk

XU Yu,REN Jing*

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Research Center of Bright Dairy & Food Co. Ltd.,Shanghai 200436,China)

Pseudomonas,one of the most harmful psychrotroph in raw milk,can easily grow to be dominant microflora in the refrigerated conditions. Most of the psychrotrophilicPseudomonassecrete the protease and lipase,resulting in milk metamorphism.The article sumerized the advance on the hazard characteristics,rapid detection methods and the new control techonology ofPseudomonas. At last,the research direction of psychrotrophilicPseudomonaswas discussed.

psychrotrophicPseudomonas;hazard;detection;control

2014-12-01

徐煜(1986-)，男，博士，研究方向:乳品安全。

*通訊作者:任婧(1980-)，女，博士，高級工程師，研究方向:乳品安全。

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD12B08；2012BAK17B14)。

TS252.1

A

1002-0306(2015)13-0380-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.072