周路+李建華+王丹+高劍峰

摘要：通過已知基因EST序列設計對特異性引物，經過2輪有限稀釋法稀釋cDNA文庫；利用特異性引物作為探針，從cDNA文庫中篩選出目的克隆，最終獲得目的基因的全長序列。在此基礎上，建立一種以CR為基礎，利用有限稀釋法快速、有效篩選噬菌體cDNA文庫、分離全長目的基因的技術體系。

關鍵詞：有限稀釋法；噬菌體；cDNA文庫；CR

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0026-03

基因克隆是基因工程和分子生物學研究的基礎，隨著2世紀生物技術的快速發(fā)展，基因克隆技術越來越多被廣泛應用[-2]。976年，Hofstetter等通過雜交質粒的方法第一個成功構建cDNA文庫[3]以來，cDNA文庫構建和篩選日益成熟并普及，并成為基因克隆及功能基因組研究的基本技術[4-5]，是最普遍、最經典的克隆全長基因序列的基本方法之一。傳統(tǒng)的篩庫方法以標記核酸探針技術為基礎，其優(yōu)點在于準確性和靈敏度高，缺點是放射性標記探針容易造成污染且同位素半衰期短不穩(wěn)定，非放射性標記探針以生物素和地高辛為基礎，成本高且所需工作量大。以CR為基礎篩選 cDNA 文庫的方法具有快捷、靈敏等特點，備受廣大科研工作者青睞，如楊曉明等以CR介導的cDNA文庫矩陣排列法進行混合基因組文庫篩選、瞿文全等建立SSS（subsection screening）篩選cDNA文庫的方法、王志成等基于96孔板CR法篩選 cDNA 文庫[6-8]，等等。本研究嘗試構建一種以CR為基礎，結合有限稀釋法篩選cDNA文庫的方法，在能夠快速有效分離出目的基因的基礎上，減少篩選cDNA文庫的工作量。

材料與方法

材料

λ噬菌體cDNA文庫篩選使用由新疆石河子大學生命科學學院構建并保存的中國美利奴羊混合組織cDNA文庫，宿主菌株為XL-Blue MRF，hagemid Excision所用菌株為XLOLR，均含四環(huán)素抗性。cDNA 文庫構建及宿主菌株來自ZA Express cDNA Synthesis Kit試劑盒，購自Stratagene公司。

2試劑

LB液體和固體培養(yǎng)基、LB broth with supplement、NZY Agar，NZY Top Agar、5×NZY Broth、SM溶液、卡那霉素、四環(huán)素，均購自索萊寶公司；ITG和X-Gal，購自科百奧公司；瓊脂粉、瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、MgSO4，均購自Amresco公司；其余分子生物學試劑均為國產。

3引物

利用GenBank中公布的綿羊[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]預測基因EST序列，用SeqMan軟件對EST序列拼接去載體，獲得目的序列。將確定好的[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]基因序列，利用比較基因組學方法，比對尋找3′和 5′-UTR區(qū)域內的高度保守序列，使用remier rimer 50軟件和NCBI上rimer-Blast工具設計特異性引物，并提交北京華大基因生物工程技術服務有限公司合成。

4CR反應條件

采用天根2×Taq CR Master Mix試劑盒，CR反應體系為：0×CR buffer，25 μL；25 mmol/L MgCl2，20 μL；0 mmol/L dNTMix，05 μL；0 μmol/L 正、反向引物，各 μL；模板，2 μL；Taq酶， U；ddH2O，補至 25 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸8 min。CR反應結束，用%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察并照相保存。

5λ噬菌體cDNA文庫篩選

λ噬菌體cDNA文庫篩選流程見圖。

5宿主菌的制備用接種環(huán)蘸取XL-Blue MRF′菌液在含有四環(huán)素終濃度為2 μg/mL的LB平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)；用接種針在平板上挑取個單菌落，于20 mL LB broth with supplement中30 ℃、220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)菌液 000 g離心5 min，棄上清，加入0 mmol/L MgSO4溶液將菌株細胞重懸稀釋調至D600 nm值為06～0，4 ℃保存?zhèn)溆?。XLOLR菌制備過程與XL-Blue MRF′相同。

52λ噬菌體cDNA目的基因確定取λ噬菌體cDNA擴增文庫菌液2 μL進行CR檢測。

53λ噬菌體cDNA擴增文庫的第輪有限稀釋篩選根據(jù)CR檢測結果能夠獲得特異性條帶，將此擴增文庫菌液E管編號0；另取0只5 mL E管并編號～0號管，加入00 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基，依次從各管中取00 μL培養(yǎng)菌液，反復吸打充分混勻，進行有限稀釋；取有限稀釋的各管菌液4 μL進行CR檢測，如～0號管CR檢測中～9號管有特異性條帶，而0號管無，則選取9號管為最大稀釋倍數(shù)的陽性管。[FL）]

[FK（W7][TZLtif][FK）]

[FL（2K2]

54最大稀釋倍數(shù)陽性管的培養(yǎng)吸取最大稀釋倍數(shù)的陽性管噬菌體cDNA擴增文庫溶液4 μL與400 μL XL-Blue MRF′宿主菌混合均勻，37 ℃溫育20 min；加入600 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基混勻，37 ℃振蕩培養(yǎng)0 h；取培養(yǎng)菌液2 μL進行CR檢測。

55文庫第2輪有限稀釋篩選經CR檢測有特異性條帶，則將對應E管編號為a；另取0支5 mL E管各加入00 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基，依次標號a～j，從培養(yǎng)過的最大稀釋倍數(shù)陽性管取00 μL菌液加入到a號管，反復吸打充分混勻，進行有限稀釋；將a～j稀釋完成的菌液 37 ℃ 振蕩培養(yǎng)0 h，取各管培養(yǎng)液2 μL進行CR檢測，確定最大稀釋倍數(shù)的陽性管；將最大稀釋倍數(shù)的陽性管37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 h，平均分裝成2管，第管進一步進行有限稀釋，驗證陽性克隆的穩(wěn)定性，驗證完成，第2管用于噬菌體單板的挑取。

6陽性噬菌體斑的挑取

經過2輪有限稀釋篩選，取最大稀釋倍數(shù)的陽性管菌液2 μL與200 μL振蕩過夜培養(yǎng)的XL-Blue MRF′菌液（D600 nm≈6）混合，并吸打均勻，于37 ℃溫育20 min；將混合菌液加入到8 mL，溫育在48 ℃的NZY Top Agar中，混合混勻后將NZY Top Agar混合液均勻地倒入預熱的NZY Agar平板上超過20 min，至平板凝固；將凝固后的平板倒置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)7～8 h，直至長出清晰的噬菌斑；逐個從平板上挑取噬菌體單斑于500 μL LB broth with supplement培養(yǎng)基，室溫條件下溫育～2 h，噬菌體溶液進行CR檢測，鑒定為陽性后進行hagemid Excision。

7hagemid Excision

在0 mL離心管中，加入50 μL混勻的噬菌體溶液，37 ℃ 溫育5 min；在離心管中加入2 mL LB broth with supplement培養(yǎng)基，37 ℃、260 r/min振蕩培養(yǎng)25～3 h；菌液 65～70 ℃ 熱激20 min，以 000 g離心5 min，收集上清于無菌離心管中；取00 μL上清與200 μL XLOLR細胞吸打混勻，37 ℃ 溫育5 min；加入40 μL 5×NZY Broth，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)45 min；加入5 μL 20% ITG和40 μL 25 mg/mL X-Gal充分混勻，取00 μL涂板在含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，倒置37 ℃培養(yǎng)過夜；用滅菌牙簽挑取平板上白色單菌落進行CR鑒定，陽性單克隆經液體培養(yǎng)，送交北京華大基因生物工程技術服務有限公司測序。

2結果與分析

2引物的設計

設計引物為[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]-F：5′-AACCAAAGCTGTTGACAGATGAGAAC-3′；R：5′-GCGCTGCAGTCGACACTAGTGGATC-3′。

22λ噬菌體cDNA擴增文庫目的基因的確定

取2 μL綿羊cDNA擴增文庫38×08 FU/mL，利用[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]引物進行CR檢測，經%瓊脂糖凝膠電泳與CR marker對比，綿羊cDNA擴增文庫在 800 bp 具有特異性條帶（圖2），表明文庫中含有目的基因。

[FK（W][TZL22tif][FK）]

23有限稀釋CR法目的基因篩選

由圖3可見，在第輪有限稀釋篩選中，～0號管均有特異性條帶，且條帶亮度逐漸降低，說明～0號管中總的克隆種類呈指數(shù)降低，目的基因克隆數(shù)在減少；9～0號管特異性條帶微弱，說明9～0管中含有目的基因克隆且克隆數(shù)很少，9～0號管為最大稀釋倍數(shù)陽性克隆管。

對9～0號管進行富集培養(yǎng)，取培養(yǎng)菌液2 μL進行CR驗[CM（25]證，結果由圖4可見，9～0號均有明顯的特異性條帶，能[CM）]

[FK（W8][TZL33tif][FK）]

[FK（W0][TZL44tif][FK）]

夠進行第2輪篩選。

取0號培養(yǎng)管菌液00 μL進行第2輪有限稀釋，取菌液經CR檢測，結果由圖5可見，a～j均出現(xiàn)特異性條帶，各稀釋管中均包含目的基因克??；a～f條帶亮度均一，g～j條帶亮度逐漸增加，表明陽性克隆數(shù)在增加。這是有限稀釋法的優(yōu)點，經過第輪和第2輪篩選，非陽性克隆在減少，陽性克隆數(shù)經過富集擴大培養(yǎng)后大量增加，能夠有效地篩選含目的基因的陽性克隆。

[FK（W9][TZL55tif][FK）]

為進一步確定j號管能夠進行hagemid Excision，對j號管進行有限稀釋驗證。由圖6可見，在有限稀釋的j號管 ～6 份檢測樣本中均有特異性條帶，表明第2輪有限稀釋能夠進行hagemid Excision。

[FK（W9][TZL66tif][FK）]

24hagemid Excision

經過2輪有限稀釋篩選，經hagemid Excision，隨機挑取6個單克隆進行CR鑒定，結果由圖7可見，4個單克隆有明顯的特異性條帶，鑒定為含有目的基因的單克隆，將單克隆菌液送交測序。

[FK（W0][TZL77tif][FK）]

25測序結果

將測序得到的TORAI基因序列，運用DNAstar中Seqman進行拼接，在NCBI上載體搜索工具VecScreen去載體，對序列進行核苷酸序列比對，并將序列提交GenBank，GenBank登錄號為KF779494。

3結論與討論

篩選cDNA文庫是獲取全長目的基因的基本方法之一。從cDNA文庫中獲得目的全長基因，建立該基因的結構、功能、表達調控等研究體系，是在基因組水平上研究特定生物器官、組織、發(fā)育時期基因表達的前提和基礎。目前，基于CR法從混合文庫中篩選陽性單克隆的方法[9，]越來越受到關注。本試驗構建了一種快速篩選噬菌體cDNA文庫的方法——有限稀釋CR法，與常規(guī)CR篩選cDNA文庫方法相比，具有操作簡便、檢測靈敏、篩選快速、經濟有效等優(yōu)點。該方法以特定基因組DNA為探針篩選噬菌體cDNA文庫中該基因的全長序列，擺脫了傳統(tǒng)噬菌體文庫鋪板培養(yǎng)、分板洗脫等較為繁瑣的操作步驟，只經過2輪CR就可篩選到目的基因，并將目的基因富集到較高水平，整個過程只需4 d時間。利用此項技術，能夠快速有效地篩選噬菌體cDNA文庫中全長序列基因，在篩選過程中不需要探針標記，降低了成本，提高了安全性，同時也降低了假陽性對試驗的干擾。

有限稀釋CR法快速篩選噬菌體cDNA文庫技術不僅原理簡單，具有普遍適用性，而且具有一定的可行性和科學性，可以根據(jù)研究需要進行改進。如需要篩選大量已知基因，可在對庫液的有限稀釋時進行多對引物不同基因的統(tǒng)一篩選，這樣使得篩選cDNA文庫更加高效；如對于某些在文庫中豐度比較低的基因，可以先有限稀釋cDNA文庫，找到最高的有限稀釋倍數(shù)再進行培養(yǎng)，提高陽性克隆在稀釋菌液中的分布，再按本試驗步驟進行2輪有限稀釋，可得到目的基因的單克隆。因此，在篩選文庫之前，應確定文庫中是否含有所要的陽性克隆，對文庫進行滴定，再進行有限稀釋確定基因的豐度；還可對λ噬菌體cDNA擴增文庫進行MASS Excision protocol，將hagemid Excision菌液保存，并利用有限稀釋CR法對大量基因進行篩選，達到高效篩選cDNA文庫的目的。