涂青梅 田剛 鄭敏 姜禎珍 羅興均 趙翔

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)是一種常見(jiàn)的并發(fā)癥，由嚴(yán)重的外傷或手術(shù)創(chuàng)傷引起。失血性休克復(fù)蘇(hemorrhagic shock followed by resuscitation，HSR)也被認(rèn)為是一種損傷，因?yàn)樗梢越?jīng)常引起全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致MODS，其中包括急性肺損傷(acute lung injury，ALI)。ALI是臨床醫(yī)生面臨的主要問(wèn)題，導(dǎo)致發(fā)病率和病死率明顯升高［1］。HS引起的SIRS的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，與很多病理生理機(jī)制都有關(guān)系。目前被大部分人接受和認(rèn)可的機(jī)制是缺血再灌注(ischaemia and reperfusion，I/R)以及對(duì)自身免疫細(xì)胞的刺激［2］。I/R損傷本身就可以誘發(fā)炎性反應(yīng)，增加細(xì)胞因子的釋放、活性氧的生成、內(nèi)皮細(xì)胞活化、一氧化氮產(chǎn)量和粘附分子的表達(dá)［2］。HS發(fā)生后，被激活的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到受損肺部，內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)增加，局部細(xì)胞因子水平也升高［1］。作為一種具有選擇性和可逆性的半胱氨酰白三烯1(cysteinyl leukotriene 1，CysLT1)受體拮抗劑，孟魯司特常被用于治療過(guò)敏性鼻炎和哮喘［3］。對(duì)消炎藥誘發(fā)的潰瘍以及阿倫磷酸鈉引起的大鼠胃黏膜損傷，孟魯司特都具有胃保護(hù)作用，原因是減輕了氧化損傷和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性［4］。此外，由于其具有抗炎抗氧化作用，孟魯司特可減輕I/R引起的多種臟器的氧化損傷［5］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，白三烯的生物合成可以減輕HS引起的肺損傷［6］。然而，孟魯司特對(duì)HSR所致ALI的影響和作用，筆者尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察孟魯司特對(duì)HS大鼠肺組織丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的影響，探討孟魯司特的肺保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年健康SD大鼠(SPF級(jí))24只，體重200～250 g，雌雄不限，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。24只大鼠隨機(jī)分為3組(n=8):假手術(shù)組(Sham組)、失血性休克復(fù)蘇致急性肺損傷模型組(HS組)、孟魯司特治療組(M組)。Sham組:在相同的時(shí)間內(nèi)接受相同的麻醉和手術(shù)過(guò)程成為休克動(dòng)物，但既不是失血性休克也不進(jìn)行液體復(fù)蘇;HS組:經(jīng)過(guò)心臟內(nèi)穿刺放血 1 h，失血量約為 50%(30 ml/kg)，失血性休克后再用林格氏液復(fù)蘇1 h，然后一直保留到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;M組:在放血前30 min接受孟魯司特7 mg/kg腹腔內(nèi)注射，在再灌注之前同樣的劑量再注射1次［5］。Sham組和HS組都接受了等量的乙醇溶液。

1.2 失血性休克模型的建立 用10%的水合氯醛350 mg/kg經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉。從左側(cè)胸部進(jìn)行心臟內(nèi)穿刺，放血時(shí)間超過(guò)2 min以上，放血量為50%(30 ml/kg)，大鼠處于休克狀態(tài)持續(xù)時(shí)間為 1 h［4］，之后通過(guò)尾部靜脈輸注乳酸林格氏溶液進(jìn)行復(fù)蘇，輸液量為失血量的2倍(60 ml/h)，輸液時(shí)間超過(guò)1 h以上。除了不放血和不復(fù)蘇之外，Sham組進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)程序。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠均保持自主呼吸。復(fù)蘇后2 h，大鼠被再次麻醉后從胸腔打開(kāi)處放血處死，直接從心臟抽取血液樣本。保留肺組織，左肺制成勻漿儲(chǔ)存起來(lái)供研究使用;右肺用10%甲醛固定進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.3 氧化應(yīng)激測(cè)量的組織制備 通過(guò)超聲波液體處理器使肺標(biāo)本成為均質(zhì)微粒，再用含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行處理，得到肺組織勻漿。4℃下，勻漿以 10 000 r/min離心15 min，保留上清以測(cè)定GSH和MDA［7］。作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，通過(guò)監(jiān)測(cè)硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)形成，從而對(duì) MDA的水平進(jìn)行分析。使用 1.56×105mol·L－1·cm－1的消光系數(shù)，MDA 類似物的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)被表達(dá)出來(lái)，表達(dá)形式為nmol MDA/g(組織)。使用412 nm比色法對(duì)GSH進(jìn)行測(cè)定。

1.4 組織取樣及組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死大鼠并取肺組織，用10%的甲醛緩沖液立即固定所有組織病理學(xué)標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)處理。顯微鏡下觀察部分標(biāo)本的組織病理學(xué)改變。采用Matute-Bello等［8］創(chuàng)立的評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肺損傷程度進(jìn)行評(píng)估。該評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肺泡間質(zhì)內(nèi)充血、肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)以及肺泡出血進(jìn)行分級(jí)。每項(xiàng)指標(biāo)被分為0～3級(jí):肺泡間質(zhì)細(xì)胞，0:肺間質(zhì)細(xì)胞稀少;1級(jí):肺間質(zhì)細(xì)胞＜1/3視野;2級(jí):肺間質(zhì)細(xì)胞占據(jù)1/3～2/3視野;3級(jí):肺間質(zhì)細(xì)胞＞2/3視野。肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn):0級(jí)，每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞＜5個(gè);1級(jí):每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞5～10個(gè);2級(jí):每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞11～20個(gè);3級(jí):每視野肺泡內(nèi)皮細(xì)胞＞20個(gè)。肺泡出血，0級(jí):沒(méi)有出血;1級(jí):1～5個(gè)肺泡中，每個(gè)肺泡至少5個(gè)紅細(xì)胞;2級(jí):5～10個(gè)肺泡中，每個(gè)肺泡至少5個(gè)紅細(xì)胞;3級(jí):＞10個(gè)肺泡中，每個(gè)肺泡至少含5個(gè)紅細(xì)胞。單項(xiàng)指標(biāo)得分相加，得到總的肺損傷評(píng)分。依據(jù)評(píng)分，肺損傷被分為三級(jí):正常(0分);輕度(1～3分);中度(4～6分);重度(7～9分)。組織學(xué)切片由病理科醫(yī)生觀察評(píng)估。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織MDA、GSH水平變化 作為肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一個(gè)主要降解產(chǎn)物，HS組大鼠肺組織MDA水平與Sham組相比明顯升高(P＜0.05);而與HS組相比，M組大鼠肺組織MDA水平則有明顯降低(P＜0.05)。與Sham組相比，HS組大鼠肺組織GSH水平明顯降低(P＜0.05)，而M組則無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠肺組織MDA、GSH水平比較n=8，±s

表1 3組大鼠肺組織MDA、GSH水平比較n=8，±s

注:與 Sham 組比較，*P ＜0.05;與 HS 組比較，#P ＜0.05

組別 MDA(nmol/g) GSH(μmol/g)Sham組95.0 ±2.8 4.36 ±0.27 HS 組 157.0 ±6.2* 2.12 ±0.25*M 組 115.1 ±5.2#3.54 ±0.40

2.2 3組大鼠急性肺損傷評(píng)分比較 Sham組大鼠的肺組織切片顯示，所有3個(gè)參數(shù)的表現(xiàn)均為正常(肺間質(zhì)細(xì)胞稀少，無(wú)肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)肺泡出血)。HS組與Sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，HS組總平均評(píng)分顯示為中度肺損傷。與HS組比較，M組大鼠肺損傷明顯減輕(P＜0.05)?？偲骄u(píng)分顯示輕度肺損傷。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠急性肺損傷評(píng)分比較n=8，分，±s

表2 3組大鼠急性肺損傷評(píng)分比較n=8，分，±s

注:與 Sham 組比較，*P ＜0.05;與 HS組比較，#P ＜0.05

組別 肺泡間質(zhì)充血 肺泡細(xì)胞浸潤(rùn) 肺泡出血 總分 總分分級(jí)Sham組0000正常HS組 1.50±0.34 2.50 ±0.22 1.83±0.16 5.83 ±0.60* 中度M 組 1.00 ±0.25 1.33 ± 0.42 0.50 ±0.34 2.33 ±0.56#輕度

3 討論

HS會(huì)引起生化和組織學(xué)變化，從而導(dǎo)致ALI的發(fā)生。孟魯司特可以阻止HS后的生化改變，對(duì)肺組織有保護(hù)作用。Eun等項(xiàng)研究中證實(shí)，脂氧合酶5通路產(chǎn)物能夠減輕 HS后的急性肺損傷［9，10］。

通過(guò)新陳代謝試驗(yàn)，GSH已被證實(shí)在宿主抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。氧化應(yīng)激的另一個(gè)重要因素是MDA，它是自由基活化的標(biāo)志。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激可以明顯升高M(jìn)DA水平而降低GSH水平，因此氧化應(yīng)激很可能是HSR發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要因素［4］。本研究結(jié)果與Kilicogluet等［11］報(bào)道一致。本研究結(jié)果顯示，與HS組相比，孟魯斯特可明顯減少休克大鼠肺組織MDA水平的升高，同時(shí)明顯升高肺組織GSH的水平，這就提示孟魯斯特對(duì)HS誘導(dǎo)的氧化肺損傷有一定的保護(hù)作用。Seneret等［12］發(fā)現(xiàn)，在慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的其他器官損傷模型中，孟魯司特可明顯降低肺組織MDA水平，同時(shí)升高肺組織GSH的水平。此外，有研究證實(shí)，孟魯司特通過(guò)其抗炎和抗氧化作用，可減輕大鼠肝臟、膀胱、睪丸和腎臟因I/R引起的氧化性損傷［4］。孟魯司特的抗氧化能力，一方面基于其自身作用，更重要的是因?yàn)樗目寡鬃饔茫傺准?xì)胞因子、趨化因子和被激活的補(bǔ)體因子會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的增加和隨后再灌注階段中性粒細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激。通過(guò)激活信號(hào)增加IL-8的生成，LTC4可影響GSH與GSSG的比率，如果用白三烯受體拮抗劑孟魯司特預(yù)處理，可明顯抑制LTC4誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)時(shí)間依賴性變化，也通過(guò)抑制NF-κB的激活來(lái)抑制IL-8生成的上調(diào)［13］。另一方面，白三烯與炎性介質(zhì)關(guān)系密切，因?yàn)樗麄兌加性黾友芡ㄍ感缘哪芰?，這是I/R損傷的共同特征。

HS組總的平均分提示中度肺損傷，其中66.7%大鼠為中度肺損傷，33.3%大鼠為重度肺損傷。與HS組相比，孟魯司特對(duì)大鼠的治療明顯減輕了肺損傷，M組總的平均分提示輕度肺損傷。雖然沒(méi)有數(shù)據(jù)表明孟魯司特對(duì)HS大鼠肺實(shí)質(zhì)有保護(hù)作用，但Souza等證實(shí)了孟魯司特的治療可以改善退化的肺上皮細(xì)胞，明顯降低慢性腎功衰引起的多器官損傷大鼠肺部炎癥細(xì)胞的數(shù)量。此外，孟魯司特可預(yù)防發(fā)熱引起的肺損傷，因?yàn)樗梢愿纳品伍g質(zhì)出血引起的大量肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和消失［14］。以I/R為模型的各種研究表明，孟魯司特可以延緩不同器官的組織病理學(xué)變化，包括肝臟、腎臟和睪丸。本研究中，孟魯司特的抑制作用主要?dú)w因于其平衡氧化-抗氧化狀態(tài)的能力以及減少促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，也可能抑制了中性粒細(xì)胞的激活和滲透。

綜上所述，孟魯司特能夠減輕失血性休克復(fù)蘇大鼠肺組織MDA水平的升高，從而減輕肺損傷，具有一定的肺保護(hù)作用。

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