房亞蘭 羅玉敏 趙詠梅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院北京市老年病醫(yī)療研究中心神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

腦卒中是指由各種血管性病因(包括出血和缺血)引起的急性或局灶性腦功能障礙。其中大部分為腦梗死所致的缺血性腦卒中。它的高病死率、高發(fā)病率給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。腦缺血再灌注過程涉及多種病理機(jī)制，如炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等。目前臨床治療缺血性腦卒中最有效的方法是早期溶栓，從而恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)。但是溶栓的時(shí)間窗短、出血風(fēng)險(xiǎn)大［2］。因此，迫切需要研究具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物，為臨床提供新的治療方法。一些動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)［3-7］表明，大黃(rhubarb)作為傳統(tǒng)中藥，具有多種藥理作用，對缺血性腦損傷有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，具有廣闊的發(fā)展前景。

1 大黃的化學(xué)成分

大黃是蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、藥用大黃(Rheum offcinale Baill.)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)的干燥根和根莖?，F(xiàn)代技術(shù)可以從大黃中分離提取出多種化合物，包括蒽醌類、多糖類、鞣質(zhì)類等。其中蒽醌類含量為3% ～5%，主要包括大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等［8］。

2 大黃的神經(jīng)保護(hù)作用

已有研究［6，9-10］表明，大黃及其化學(xué)成分具有抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、減少一氧化氮(nitric oxide，NO)過量產(chǎn)生、清除自由基、抑制細(xì)胞凋亡等多種生物功能。大黃單味藥及其主要成分均能明顯減少腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積、降低神經(jīng)功能評分，發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用［3-5］。

2.1 大黃的抗炎作用

2.1.1 大黃可抑制炎性反應(yīng)因子的表達(dá)

研究［4，9，11-12］表明，大黃的多種化學(xué)成分都具有減少炎性因子表達(dá)、保護(hù)腦組織的作用。缺血再灌注的腦組織損傷伴隨著NALP3炎性反應(yīng)復(fù)合體的激活，使用成年雄性CD1小鼠制作短暫性大腦中動脈梗死模型(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)，在梗死前30 min分別給模型小鼠腹腔注射高、中、低劑量的大黃酚(10 mg/kg，1 mg/kg，0.1 mg/kg)，術(shù)后24 h處死小鼠，研究顯示，大黃酚高、中劑量組明顯地抑制NALP3炎性反應(yīng)復(fù)合體和白細(xì)胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用［4］。腦缺血損傷時(shí)，腦組織內(nèi)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β和血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)升高，轉(zhuǎn)化生長因子 -β(transforming growth factor-β，TGF-β)降低，參與腦缺血損傷的病理過程［13-15］。

李建生等［14-15］對于大黃苷元和大黃素做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。使用3～4月齡SD大鼠制作MCAO模型，于造模前3 d給大鼠灌胃(每日1次，造模前2 h加1次)低、中、高劑量(25.92、51.84和103.68 mg·kg-1·d-1)的大黃苷元，術(shù)后6 h發(fā)現(xiàn)大黃苷元低劑量組顯著降低缺血大鼠腦組織中TNF-α蛋白和IL-1β蛋白及 VCAM-1 mRNA的表達(dá)，增高 TGF-β蛋白，由此抑制炎性級聯(lián)反應(yīng)，減輕腦組織損傷。腹腔注射不同劑量(1.404、2.808和5.616 mg·kg-1·d-1)的大黃素均能減輕腦缺血損傷，其中低劑量大黃素作用顯著，可明顯降低腦缺血組織TNF-α蛋白、IL-1β蛋白和 VCAM-1蛋白，抑制 VCAM-1 mRNA表達(dá)，提高 TGF-β 蛋白，減輕炎性反應(yīng)，保護(hù)腦組織［11］。

大黃素甲醚也具有抑制相關(guān)炎性反應(yīng)因子的作用。張平等［16］用放射免疫等方法檢測到大黃素甲醚降低腦缺血再灌注后腦組織中IL-1β蛋白、細(xì)胞黏附分子-1蛋白和caspase-3蛋白，減輕腦缺血再灌注損傷。陳立英等［17］在提前給予短暫的缺血預(yù)處理(brain ischemic preconditioning，BIP)基礎(chǔ)上進(jìn)行大黃素甲醚抗炎治療，發(fā)現(xiàn)大黃素甲醚對BIP誘導(dǎo)的缺血耐受有一定的增強(qiáng)作用，二者對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中IL-1β蛋白和TNF-α蛋白的表達(dá)下調(diào)具有疊加作用。進(jìn)一步研究表明，BIP和大黃素甲醚預(yù)處理都可誘導(dǎo)腦缺血耐受，大黃素甲醚通過抑制IL-1β蛋白和TNF-α蛋白的過度產(chǎn)生，減輕局灶性腦缺血再灌注損傷［12］。此外，大黃素呈劑量依賴地有效抑制干擾素-γ和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞中白細(xì)胞介素-8的產(chǎn)生［18］。

2.1.2 大黃抑制NO過量生成

腦缺血再灌注損傷時(shí)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase，iNOS)表達(dá)上調(diào)，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的上游信號通路激活，產(chǎn)生大量NO，促進(jìn)神經(jīng)損傷［19］。抑制iNOS的表達(dá)及NO的過量產(chǎn)生，將有利于腦組織的再灌注及減少腦缺血的損傷程度［20-21］。研究［9，22］表明，大黃不僅能夠抑制炎性反應(yīng)因子，還能抑制過量的NO生成，發(fā)揮抗炎作用。李建生等［22］用雙側(cè)頸總動脈缺血模型實(shí)驗(yàn)證明，大黃粉及大黃的4個(gè)不同部位(乙酯部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位)能顯著降低腦組織及血清中的TNF-α和NO，拮抗TNF-α引發(fā)的一系列損傷性反應(yīng)，減輕NO介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，從而減輕炎性反應(yīng)，改善缺血后的腦組織損傷。也有實(shí)驗(yàn)［5，23-24］研究了大黃及其主要成分抑制NO過量產(chǎn)生的作用。瀉心湯由大黃、黃連、黃芩組成，給LPS誘導(dǎo)的急性炎性反應(yīng)模型小鼠使用瀉心湯能抑制血漿中iNOS的活性，減少 NO 的產(chǎn)生［23］。進(jìn)一步的研究［24］表明，瀉心湯中的大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素成分能有效抑制LPS誘導(dǎo)的急性炎性反應(yīng)模型大鼠和巨噬細(xì)胞株Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO，其中大黃酸發(fā)揮直接的抗炎作用，大黃素、蘆薈大黃素則發(fā)揮間接抗炎作用。近年來，對于大黃酸的抗炎作用，王小榮等［5］做了進(jìn)一步研究，實(shí)驗(yàn)采用改良的Himori法制備小鼠全腦缺血再灌注模型，結(jié)果表明，大黃酸可抑制NO的升高，緩解神經(jīng)毒性作用，并且中劑量(1.0 mg/kg)大黃酸降低NO的作用明顯，大劑量(10.0 mg/kg)次之，小劑量(0.1 mg/kg)的作用最小。上述研究［5，9，22-24］表明，大黃的多種化學(xué)成分能有效抑制炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生及NO的過量生成，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2 大黃的抗氧化作用

氧化應(yīng)激即細(xì)胞內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生和清除的失衡。過量的ROS破壞細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，產(chǎn)生氧化損傷，參與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷，是腦缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機(jī)制［25］。細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等多種具有抗氧化作用的物質(zhì)，可以清除ROS，在腦缺血后，機(jī)體的抗氧化活性起到重要的神經(jīng)保護(hù)作用［26］。

2.2.1 大黃能增強(qiáng)抗氧化酶活性

王樹等［27］對大黃素的抗氧化作用展開了大量實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果證明大黃素能提高腦缺血再灌注損傷后腦組織和血液中GSH-PX和SOD的活力，改善由腦缺血再灌注損傷引起的學(xué)習(xí)記憶障礙和探索功能障礙，延長腦缺血再灌注損傷后的耐缺氧生存時(shí)間。大黃素還能夠增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠腦中CAT的活性，促進(jìn)強(qiáng)氧化劑過氧化氫分解，減少氧自由基的生成［28］。荔志云等［29］用缺氧所致大鼠腎小腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分株(PC12)細(xì)胞損傷模型發(fā)現(xiàn)，大黃酚能促進(jìn)PC12細(xì)胞生成SOD，發(fā)揮保護(hù)作用。

大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷可以顯著減少Wistar大鼠腦缺血再灌注模型的神經(jīng)功能評分、腦梗死體積，增強(qiáng)SOD活性、總抗氧化能力，降低腦組織中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)，并且這種保護(hù)作用呈劑量依賴性;測定血液和腦組織中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷，發(fā)現(xiàn)大黃素 -8-O-β-D-葡萄糖苷能夠通過血腦脊液屏障進(jìn)入腦組織［10］。用谷氨酸誘導(dǎo)胎鼠皮質(zhì)細(xì)胞，引起乳酸脫氫酶釋放，增強(qiáng)線粒體活性，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對二者有顯著抑制作用，從而發(fā)揮直接的保護(hù)作用［10］。Ca2+介導(dǎo)自由基參與的缺血性腦損害過程，在連鎖反應(yīng)中，可釋放具有高度活性的自由基，加劇缺血損傷。大黃苷和苷元可顯著減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，增強(qiáng)SOD活性，降低 MDA，拮抗自由基損傷，保護(hù)缺血性腦組織［30］。

2.2.2 大黃可清除自由基

蘆薈大黃素不僅能增強(qiáng)阿爾茲海默病模型大鼠腦組織中SOD、GSH-PX的活性，降低MDA，而且能有效抑制過氧化氫引起的PC12細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生［31］。李萬林等［32］對大黃多糖抗氧化性的研究表明，大黃多糖能明顯清除1，1-二苯基-2-苦肼基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，且大黃多糖濃度與DPPH自由基清除率之間存在量效關(guān)系。當(dāng)大黃多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg·mL-1時(shí)，它接近于維生素C對自由基的清除率。

羅志毅等［33］采用電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance，ESR)檢測發(fā)現(xiàn)，大黃中清除超氧陰離子的主要成分是大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素。并且大黃酚質(zhì)量濃度越高，清除超氧自由基的能力越強(qiáng)，質(zhì)量濃度為0.39 mg·mL-1時(shí)，超氧自由基清除率達(dá)100%。由二甲基亞砜捕捉超氧自由基后在ESR上呈現(xiàn)的典型波譜圖可知，加入大黃酚后ESR波普的峰值明顯下降，說明大黃酚有良好的超氧自由基清除力。

盡管大部分研究［31-33］表明大黃中的主要成分具有抗氧化作用，但一些實(shí)驗(yàn)［34-35］也得到了不同的研究結(jié)果。在抑制亞油酸過氧化的實(shí)驗(yàn)中，抗氧化性由高到低依次是，叔丁基羥基茴香醚(96%)，蒽酮(95%)，茜素(93%)，蘆薈大黃素(78%)，大黃酸(71%)，大黃素(36%)，蒽醌(8%)，而大黃酚加速亞油酸的過氧化反應(yīng);在清除羥基的實(shí)驗(yàn)中，相同質(zhì)量濃度的蒽酮、蘆薈大黃素和大黃素對羥基的清除率分別是26.2%，16.6%及41.8%，然而在同等質(zhì)量濃度下，蒽醌、茜素、大黃酚和大黃酸加快羥基自由基的產(chǎn)生［34］。另有研究［35］表明，對大黃組成成分的自由基清除力篩選實(shí)驗(yàn)表明，芪類和萘苷有自由基清除力，而蒽醌類和番瀉苷沒有這種作用。

2.3 大黃可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡在缺血再灌注早期即可發(fā)生，主要分布在缺血壞死灶的邊緣區(qū)域，多種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，包括B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)和B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，bax)等在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Bcl-2的表達(dá)，抑制caspase-3的激活，保護(hù)細(xì)胞器膜的穩(wěn)定性，增加腦組織內(nèi)bcl-2的表達(dá)可以減少細(xì)胞凋亡。Bax與bcl-2相拮抗，bax的增加會促進(jìn)細(xì)胞凋亡。上調(diào)bcl-2、下調(diào)bax的表達(dá)，能夠減少神經(jīng)元凋亡［36］。研究［37］表明，大黃及其主要成分不僅具有抗炎、抗氧化的作用，而且能抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦組織。

研究［6］發(fā)現(xiàn)，大黃酚和大黃酚脂質(zhì)體能上調(diào)bcl-2的表達(dá)，下調(diào)caspase-3和bax的表達(dá)，抑制腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元的丟失，保護(hù)腦缺血損傷。嚴(yán)志康等［38］用免煎中藥大黃給MCAO模型大鼠連續(xù)灌胃4 d(每天灌胃1次)，結(jié)果顯示，大黃能夠上調(diào)缺血側(cè)腦半球缺血區(qū)及周邊區(qū)bcl-2的表達(dá)，下調(diào)缺血側(cè)腦半球缺血區(qū)及周邊區(qū)bax的表達(dá)，增加bcl-2/bax的比例，在大鼠腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮抗凋亡作用。進(jìn)一步研究［39］發(fā)現(xiàn)，活血通脈湯(由大黃、桃仁、土鱉蟲、黃芪和瓜蔞皮組成)和大黃都具有減少缺血側(cè)腦半球缺血區(qū)及周邊區(qū)caspase-3蛋白的表達(dá)和增加缺血側(cè)腦半球缺血區(qū)及周邊區(qū)bcl-2蛋白表達(dá)，拮抗大鼠局灶性腦缺血再灌注后細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡的作用。但活血通脈湯藥效優(yōu)于大黃，說明活血通脈湯中的某些其他成分可能與大黃有協(xié)同作用［39］。

通過過氧化氫誘導(dǎo)原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究［40］發(fā)現(xiàn)，大黃素能增加bcl-2/bax的比例，抑制過氧化氫導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。張明等［41］在細(xì)胞水平上研究大黃素甲醚對細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)大黃素甲醚減少乳酸脫氫酶的釋放和c-fos蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用。大黃素能減少caspase-3蛋白的表達(dá)，抑制缺糖缺氧對細(xì)胞的損傷［42］。以上研究表明，大黃及其主要成分通過介導(dǎo)bcl-2、bax和caspase-3等抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕缺血腦組織損傷［6，38-42］。

綜上所述，大黃在腦血管病方面發(fā)揮十分廣泛的作用，越來越受到人們的重視。目前研究［4-6，14-15，22，38發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注模型中，大黃具有抑制炎性反應(yīng)因子表達(dá)、NO過量生成、細(xì)胞凋亡等作用。但大黃的主要成分對于清除自由基的作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證，大黃發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的確切機(jī)制和作用靶點(diǎn)尚不明確，各成分間的相互作用及影響尚不清楚。人們對大黃的深入研究，必將有利于開發(fā)修復(fù)保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的新藥，從而為腦血管病的早期防治提供新途徑。

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