天津市北辰區(qū)疾病預(yù)防控制中心（300400）趙鳳仙

曲霉是自然界中普遍存在的空氣播散性腐物寄生菌，最常見的是煙曲霉、黃曲霉及黑曲霉，焦曲霉和土曲霉較少見。這些真菌，尤其是煙曲霉，能引起嚴(yán)重的后果并危及生命。近幾年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種疾病的治療手段不斷創(chuàng)新，如造血干細(xì)胞移植術(shù)、器官移植術(shù)、腫瘤化療術(shù)的廣泛開展，廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，致使由曲霉菌感染所致的侵襲性曲霉病(IA)發(fā)病率逐漸增多。由于缺乏特征性臨床癥狀和影像學(xué)指征，微生物學(xué)檢驗(yàn)如真菌培養(yǎng)的敏感性很低，組織病檢屬于有創(chuàng)操作，很多危重患者、免疫功能低下、全血細(xì)胞減少的患者對(duì)其耐受性差，且組織病檢耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，對(duì)于病情進(jìn)展迅速的IA早期診斷價(jià)值有限[1]，IA的診斷仍舊困難，多數(shù)IA往往死后才能確診[2][3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，推動(dòng)了侵襲性曲霉病分子診斷技術(shù)的發(fā)展。分子診斷技術(shù)具有特異性和敏感性高、快速等優(yōu)點(diǎn)。本文就侵襲性曲霉病的分子診斷技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

聚合酶鏈反應(yīng)(p o l y m e r a s e c h a i n reaction，PCR)法作為無(wú)創(chuàng)性的檢測(cè)方法，近年來(lái)已成為IA早期診斷上的研究熱點(diǎn)。PCR法是一種快速、敏感性高的診斷手段，不僅可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到微量曲霉菌的DNA，而且可以鑒別曲霉菌的種類。但該技術(shù)目前還沒(méi)有納入歐洲癌癥/真菌感染研究和治療工作小組2008年診斷標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有相關(guān)指南推薦，以及其本身缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，阻礙了其自身的發(fā)展。但近年的一些研究讓人們看到PCR法的價(jià)值。目前有商品化試劑盒可提取真菌DNA，方便、快速。隨著DNA自動(dòng)化提取技術(shù)的發(fā)展，可以排除真空泵、離心機(jī)和其他手工步驟對(duì)標(biāo)本的交叉污染，降低PCR反應(yīng)的假陽(yáng)性。另外，抽提DNA時(shí)所用標(biāo)本量對(duì)于PCR檢測(cè)結(jié)果也有一定影響。已報(bào)道的PCR法診斷IA的敏感性和特異性差異較大，可能是與各研究者所用PCR法的樣本種類、引物、核酸抽提方法和檢測(cè)體系不同有關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)PCR的敏感性比抗原檢測(cè)差[4]。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。金欣[5]等利用LightCycler儀器建立了一種簡(jiǎn)便、特異的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，用于系統(tǒng)性曲霉感染的快速檢測(cè)。通過(guò)微機(jī)控制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和結(jié)果自動(dòng)分析，不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)處理，還做了相應(yīng)的溶解曲線，根據(jù)標(biāo)本溶解曲線有無(wú)峰及峰的位置可判斷標(biāo)本有無(wú)特異性擴(kuò)增，從而克服PCR可能有假陽(yáng)性結(jié)果的缺點(diǎn)；并且證實(shí)了他們建立的PCR體系有良好的特異性和敏感性，其煙曲霉DNA檢測(cè)下限可達(dá)到10fg。斑點(diǎn)雜交是將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，然后用標(biāo)記探針與之雜交。用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量分析，方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、樣品量少。其缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽(yáng)性。同一種標(biāo)本經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋，還可以得到半定量的結(jié)果，所以它是一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的分析DNA或RNA的方法。王莉等[6]通過(guò)PCR擴(kuò)增曲霉28S rRNA保守序列，結(jié)合4種標(biāo)記biotin的曲霉種特異性探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，成功鑒定臨床常見的曲霉，并可能檢測(cè)到這4種真菌的混合感染，具有很好的應(yīng)用前景。

3 DNA芯片技術(shù)

該技術(shù)是用免疫熒光標(biāo)記的待測(cè)樣品與有規(guī)律地固定在芯片片基上的大量探針按堿基配對(duì)原則進(jìn)行雜交。其突出特點(diǎn)在于高度并行性、多樣性、微型化和自動(dòng)化。將不同屬種真菌的特異性DNA標(biāo)記后制成DNA芯片，將致病真菌DNA與DNA芯片雜交就可得到屬種特異性圖譜，通過(guò)這種圖譜的比較和分析，就可得出致病菌的DNA信息，進(jìn)而可對(duì)其進(jìn)行鑒定。

4 基因探針技術(shù)

基因探針技術(shù)結(jié)合了酶切圖譜法和分子雜交法，原理是應(yīng)用一段帶有標(biāo)記的特異性核苷酸序列，通過(guò)雜交檢測(cè)與探針互補(bǔ)的DNA或RNA片段?；蛱结樇夹g(shù)與其他一些分子生物學(xué)技術(shù)(如IPCR技術(shù))結(jié)合，可以具有很高的敏感性。常用的探針基因組DNA探針，cDNA探針，寡核苷酸探針，RNA探針。常用的標(biāo)記物為放射性核素和非放射性核素如生物素、熒光素、抗原及抗體等。由于DNA探針從DNA水平上檢測(cè)病原微生物，不受其純度的影響，能直接用于標(biāo)本檢測(cè)，從而解決不易培養(yǎng)的微生物的鑒定問(wèn)題。同時(shí)，它又能在一張濾膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)，縮短了大量樣品檢測(cè)的時(shí)間。

盡管分子診斷技術(shù)在侵襲性真菌感染診斷中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但目前尚無(wú)法取代傳統(tǒng)的診斷技術(shù)。不同實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)的具體方法并不一致。IFD診斷仍是一個(gè)困擾臨床醫(yī)生的問(wèn)題。隨著科技的進(jìn)步，侵襲性曲霉病的分子診斷技術(shù)的方法將不斷完善更新，并逐漸向快速、敏感、特異的目標(biāo)發(fā)展，它們的快速發(fā)展讓我們對(duì)侵襲性曲霉病的早期診斷充滿期待。