天津市北辰區(qū)疾病預(yù)防控制中心（300400）趙永勝

流感(Influenza)是呈全球分布的傳染病，各個國家都有不同程度的發(fā)生，其發(fā)病率和造成的死亡人數(shù)至今仍列傳染病之首。流感也威脅著多種家畜、家禽甚至很多珍稀野生動物的繁衍和生存，對各國經(jīng)濟造成極大的影響[1]。流感病毒屬于正黏液病毒科，是常見的呼吸道病毒，其基因組為分片段的單股負鏈RNA。根據(jù)其核蛋白的抗原性，可將人流感病毒分為甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)等3類。根據(jù)其核蛋白和基質(zhì)蛋白的不同，將流感病毒共分4個屬，其中甲型流感病毒又可根據(jù)病毒粒子血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原性的不同分為不同的亞型[2]。甲型流感病毒經(jīng)呼吸道由飛沫傳播，傳播迅速，潛伏期短，曾多次引起世界性大流行。乙型和丙型流感病毒只感染人類，多引起局部流行，丙型流感病毒并不會引起嚴重的疾病，常散發(fā)出現(xiàn)。近年來流感的頻頻發(fā)生，更是直接威脅人類生命，所以建立對流感病毒方便 、快速、準確的檢測方法，對于流感患者的臨床診斷和及時有效的治療具有重大的意義。早期的血清學(xué)和免疫學(xué)等診斷方法由于其耗時長、靈敏度低、程序復(fù)雜等缺陷逐漸被更精確更快速的分子生物學(xué)診斷所替代，本文就目前流感病毒的分子生物學(xué)診斷技術(shù)進展綜述如下。

1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一項在短時間內(nèi)大量擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR用于病原體的確定，可檢測早期感染的病人，至少比病毒分離方法敏感500倍，但一般PCR易污染?；谝话鉖CR原理的基礎(chǔ)上，先后建立了多種PCR 相關(guān)檢測方法，如RT-PCR[3]、多重RT-PCR、熒光定量PCR等。RT-PCR具有敏感性高、特異性強、所需抗原量相對較少等優(yōu)點。多重RT-PCR方法可以同時檢測樣品中可能存在的病毒，具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟性。由于在反應(yīng)中加入多種引物，這就需要摸索最佳反應(yīng)條件，選擇的引物之間必須互不干擾，更不能產(chǎn)生交互效應(yīng)。多重RT-PCR可以同時檢測不同病毒的這種優(yōu)勢補償了其反應(yīng)的敏感性比 RT-PCR略低的缺點。目前唯一經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的甲型流感病毒快檢試劑盒就是依靠多重RT-PCR方法實現(xiàn)的。熒光定量PCR分子診斷技術(shù)，是在病毒檢測RT-PCR基礎(chǔ)上，利用PCR對DNA的高效擴增，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性以及定量的特點，具有直觀，重復(fù)性好，特異性強，敏感性高和易操作等優(yōu)點。實時RT-PCR具有特異性強，有效解決了PCR污染問題、自動化程度高等特點，且具有高重現(xiàn)性、定量性。張鵬超等[4]建立的豬流感病毒SYBR Green I定量RT-PCR檢測方法，對豬流感病毒核酸檢測靈敏度達到30TCID50。

2 依賴核酸序列的擴增法(NASBA)

依賴核酸序列的擴增技術(shù)(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)是一項以RNA為模板的快速等溫電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，這項技術(shù)檢測的樣品無需特殊處理，在恒定的溫度條件下即可直接擴增單鏈RNA。該技術(shù)的特點是操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，能在4～6h完成整個核苷酸的分離、擴增和檢測，但其要求對引物的選擇進行優(yōu)化。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP)

LAMP是一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其原理是針對靶基因個別區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。劉中勇等[5]運用相似的技術(shù)建立H3亞型流感病毒的RT-LAMP檢測方法。LAMP對于流感病毒的檢測具有恒溫、快速、高效、高特異性等特點。

4 焦磷酸測序法

焦磷酸測序技術(shù)是由Nyren等于1987年發(fā)展起來的一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，是針對短到中等長度的DNA序列樣品進行高通量、高精確度(99%精確)和再現(xiàn)性好的分析技術(shù)。焦磷酸測序技術(shù)已被用于基因分型、疾病基因測序、DNA測序與二級結(jié)構(gòu)分析。

5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)[6]是指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、DNA芯片，主要用于DNA序列測定，基因表達圖譜鑒定、基因突變體檢測分析，基因組功能研究。夏駿等[7]通過實驗證明該方法具有較高的靈敏度和特異性，但這種方法對實驗條件要求較高，價格昂貴，不方便一般實驗室的檢測?；蛐酒哂袦蚀_、快速、高通量等特點，在疾病診斷和病毒的快速檢測中具有廣泛地應(yīng)用前景。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用于流感病毒基因檢測的新技術(shù)會層出不窮，除了文章介紹的幾種技術(shù)外，還有原位雜交技術(shù)等。在臨床流感防控工作中，各個實驗室可根據(jù)具體的條件來選擇適合各自的診斷方法，發(fā)揮各自的優(yōu)點，只有這樣才能提高工作效率和得到好的效果，必將在流感的預(yù)防、監(jiān)測和控制中發(fā)揮更為積極和重要的作用。相信隨著各國科研工作者的不懈努力，在不久的將來會研制出更加有效的流感病毒分子診斷檢測方法。