魏海青 郭燕 胡殿珍 羅環(huán)

葉酸(Folic acid)維生素B復(fù)合體之一，是米切爾(H.K.Mitchell，1941)從菠菜葉中提取純化的，故而命名為葉酸。是合成核酸所必需的元素，是細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)所必需的物質(zhì)，更是胚胎發(fā)育過(guò)程中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素。有“優(yōu)生優(yōu)育的營(yíng)養(yǎng)素”美譽(yù)，對(duì)孕婦尤其重要［1］。1997年衛(wèi)生部開(kāi)始推薦孕女性性統(tǒng)一補(bǔ)充葉酸，劑量為400 μg/d。該措施在出生缺陷預(yù)防中起了重要作用，但由于孕婦對(duì)葉酸的代謝能力不足，出生缺陷的發(fā)生率仍存在很大的地域差異。對(duì)于葉酸代謝能力正常的孕婦來(lái)說(shuō)，每天補(bǔ)充400 μg葉酸是足夠的，但是對(duì)葉酸代謝能力存在障礙的孕婦來(lái)說(shuō)，應(yīng)該相應(yīng)增加補(bǔ)充劑量，并加強(qiáng)孕期各項(xiàng)檢測(cè)。據(jù)我國(guó)婚前育齡女性血清抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)城市和農(nóng)村女性缺乏葉酸者分別有21%和38%。而孕婦由于攝入不足、胎兒需要量大、尿中排除量比平時(shí)多等原因更容易缺乏葉酸。據(jù)衛(wèi)生部及疾控中心相關(guān)報(bào)告，我國(guó)每年將有90萬(wàn)新生兒缺陷性疾病誕生，患出生缺陷排在前5位的包括:先天性心臟病，神經(jīng)管畸形，唇腭裂，唐氏綜合征，多指(趾)，這些多與孕婦葉酸缺乏有一定關(guān)系。當(dāng)前，為了降低新生兒出生缺陷，孕婦妊高癥和流產(chǎn)的發(fā)病率，臨床上根據(jù)衛(wèi)生部推薦孕期女性統(tǒng)一補(bǔ)充葉酸的劑量為400 μg/d，但由于每個(gè)人葉酸能力代謝不同，利用能力也出現(xiàn)差異，仍然出現(xiàn)一定數(shù)量的新生兒缺陷性疾病。因此通過(guò)基因位點(diǎn)檢測(cè)，個(gè)性化補(bǔ)充葉酸，特別是研究基因突變則是探討這些疾病發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵。利用現(xiàn)代基因分型技術(shù)檢測(cè)孕母葉酸代謝相關(guān)基因，根據(jù)基因分型結(jié)果對(duì)受檢者葉酸利用能力進(jìn)行分級(jí)，進(jìn)而針對(duì)性的調(diào)整葉酸補(bǔ)充劑量具有深遠(yuǎn)的意義。［2］

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在2014年1月至12月對(duì)河北省豐寧滿族自治縣計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)站和北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心進(jìn)行了葉酸利用能力遺傳基因檢測(cè)的圍孕期女性400例，年齡21～40歲，以上病例均由指定幾家醫(yī)院及計(jì)劃生育研究所提供相關(guān)調(diào)查表并跟蹤記錄。按照有無(wú)不良孕史分為有不良孕史的為觀察組(n=68)，無(wú)不良孕史為對(duì)照組(n=332)。觀察組21～25歲22例，26～30歲26例，31～35歲10例，36～40歲2例。對(duì)照組21～25歲68例，26～30歲196例，31～35歲46例，36～40歲22例。同時(shí)也進(jìn)行了對(duì)個(gè)體化葉酸補(bǔ)充相關(guān)知識(shí)的了解情況的調(diào)查，對(duì)這68例有不良孕產(chǎn)史的圍孕期女性的個(gè)體化葉酸補(bǔ)充知識(shí)了解情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，了解葉酸個(gè)體化補(bǔ)充相關(guān)知識(shí)的32例，不了解的36例;對(duì)這332例有不良孕產(chǎn)史的圍孕期女性的個(gè)體化葉酸補(bǔ)充知識(shí)了解情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，了解個(gè)體化葉酸補(bǔ)充相關(guān)知識(shí)的占172例，不了解的占160例。

1.2. 檢查方法:采用咽拭子法。讓受檢者用0.9%氯化鈉溶液漱口2次后，通過(guò)采樣器咽拭子在被檢者口腔黏膜刮取脫落細(xì)胞，提取DNA，采用Taqman-MGB技術(shù)，對(duì)亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因-C677T、A1298C和MTRR基因位點(diǎn)-A66G的單核苷酸多態(tài)性分型進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，相關(guān)儀器、試劑均為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR結(jié)果 經(jīng)終點(diǎn)熒光讀取，區(qū)分檢測(cè)樣本攜帶的不同基因型(雜合、野生純合、突變純合)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)綜合，以上每個(gè)檢測(cè)樣本的三個(gè)基因位點(diǎn)數(shù)據(jù)均被采集。

2.2 葉酸利用能力遺傳檢測(cè)相關(guān)結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況

2.2.1 葉酸利用能力遺傳檢測(cè)基因型情況:葉酸利用能力遺傳檢測(cè)基因型情況包括雜合型、野生純合型［3］、突變純合型。關(guān)于MTHFR基因位點(diǎn)C677T上的基因型常見(jiàn)的有CC(正常)，CT(正常)、TT(風(fēng)險(xiǎn))，其中TT風(fēng)險(xiǎn)基因型在我國(guó)人群中所占比例為28%;關(guān)于MTHFR基因位點(diǎn)A1298C上的基因型常見(jiàn)的有AA(正常)、AC(正常)、CC(風(fēng)險(xiǎn))，其中，CC 風(fēng)險(xiǎn)基因型在我國(guó)人群中所占比例為4%;關(guān)于MTRR基因位點(diǎn)A66G上的基因型常見(jiàn)的有AA(正常)、AG(正常)、GG(風(fēng)險(xiǎn))，其中GG風(fēng)險(xiǎn)基因型在我國(guó)人群中所占比例6%。見(jiàn)表1。

表1 葉酸利用能力檢測(cè)基因型情況

2.2.2 葉酸利用能力風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)情況:根據(jù)各基因位點(diǎn)功能、純合、雜合及出現(xiàn)頻率，葉酸利用能力風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)情況一般分為七級(jí)，其中零級(jí)為未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)，表明葉酸利用能力正常;一級(jí)和二級(jí)為低度風(fēng)險(xiǎn)，表明葉酸利用能力略差;三級(jí)、四級(jí)和五級(jí)為中度風(fēng)險(xiǎn)，表明葉酸利用能力較差;六級(jí)和七級(jí)為高度風(fēng)險(xiǎn)，表明葉酸利用能力很差。見(jiàn)表2。

表2 葉酸利用能力基因檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)情況

2.2.3 觀察組與對(duì)照組葉酸利用能力統(tǒng)計(jì)情況:根據(jù)葉酸利用能力基因檢測(cè)中基因分型結(jié)果，對(duì)受檢者葉酸利用能力進(jìn)行分級(jí)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下:觀察組68例患者中，葉酸利用能力正常的為1例，占1.47%;葉酸利用能力略差的為8例，占11.76%;葉酸利用能力較差的為49例占72.06%;葉酸利用能力很差的為10例，占14.71%。對(duì)照組332例患者中，葉酸利用能力正常的為50例，占15.06%;葉酸利用能力略差的為112例，占33.73%;葉酸利用能力較差的為146例占43.98%;葉酸利用能力很差的為24例，占7.23%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組患者葉酸利用能力級(jí)別情況(正常、略差、較差、很差)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組葉酸利用能力級(jí)別情況對(duì)比 例(%)

2.2.4 個(gè)體化補(bǔ)充葉酸參考量:對(duì)MTHFR基因、MTRR基因及其相關(guān)位點(diǎn)的檢測(cè)，可以直接發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)者葉酸代謝方面的遺傳缺陷(即葉酸的利用能力)，從而根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)高低(相關(guān)代謝酶的活性程度)建議更準(zhǔn)確的補(bǔ)充劑量，例如:對(duì)于葉酸利用能力基因檢測(cè)結(jié)果正常的孕齡女性，在孕前3個(gè)月至孕早期補(bǔ)充400 μg/d，孕后期注意食物補(bǔ)充就可以了;對(duì)于檢測(cè)結(jié)果略差的注意孕前3個(gè)月、孕早期、孕中及后期堅(jiān)持補(bǔ)充400 μg/d;對(duì)于檢測(cè)結(jié)果較差的孕齡女性，注意孕前3個(gè)月補(bǔ)充 400 μg/d，而孕早期注意增加到800 μg/d，孕中及后期 400 μg/d;對(duì)于檢測(cè)結(jié)果很差的孕齡女性，注意在孕前3個(gè)月及孕早期均補(bǔ)充800 μg/d，孕中及后期補(bǔ)充 400 μg/d。由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心組織的孕齡女性(孕前3個(gè)月、孕早期、孕中/孕后期)葉酸利用能力檢測(cè)所提供的增補(bǔ)參考量情況。見(jiàn)表4。

表4 葉酸利用能力基因檢測(cè)提供的增補(bǔ)參考量情況 μg/d

3 討論

葉酸作為水溶性B族維生素中的一種，過(guò)去認(rèn)為它主要是參與造血。但隨著對(duì)其研究的深入，它的缺乏與多種疾病有關(guān)，特別與孕婦和新生兒疾病有著密切的關(guān)系。導(dǎo)致機(jī)體缺乏葉酸有兩個(gè)方面的原因:(1)葉酸攝入量不足，(2)由于遺傳(基因)缺陷導(dǎo)致機(jī)體對(duì)葉酸的利用能力低下即葉酸代謝通路發(fā)生障礙。而葉酸缺乏是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的主要原因，應(yīng)引起對(duì)孕婦葉酸利用能力檢測(cè)的高度重視。［4］

國(guó)外通過(guò)基因位點(diǎn)檢測(cè)，評(píng)估葉酸利用能力的強(qiáng)弱，個(gè)體化指導(dǎo)孕齡女性補(bǔ)充葉酸的研究開(kāi)展較早，并收到很好的孕婦和新生兒疾病預(yù)防效果。但由于人種、遺傳因素、環(huán)境因素、飲食因素等的差異，有必要根據(jù)我國(guó)孕齡女性的現(xiàn)狀，進(jìn)一步開(kāi)展這方面的研究［5］。有相關(guān)葉酸利用能力遺傳(基因)檢測(cè)涉及的基因和位點(diǎn)的研究顯示:MTHFR全稱5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶)基因的C677T位點(diǎn)上的基因型有以下三種，CC(正常);CT(正常);TT(風(fēng)險(xiǎn))，三種基因型在中國(guó)人群中所占比例分別為22%;50%;28%。MTHFR基因的A1298C位點(diǎn)上的基因型也有三種，AA(正常);AC(正常);CC(風(fēng)險(xiǎn))，三種基因型在中國(guó)人群中所占比例分別為66%;31%;4%。MTRR基因全稱5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase，編碼甲硫氨酸合成酶還原酶，該基因的A66G位點(diǎn)上的三種基因型為AA(正常);AG(風(fēng)險(xiǎn));GG(風(fēng)險(xiǎn))，三種基因型在中國(guó)人群中所占比例分別為58%;36%;6%。綜上所述，通過(guò)對(duì)MTHFR基因、MTRR基因及其相關(guān)位點(diǎn)的檢測(cè)，可以直接發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)者葉酸代謝方面的遺傳缺陷(即葉酸的利用能力)［6］，再依據(jù)以上各基因位點(diǎn)的功能、純合、雜合及其出現(xiàn)頻率可以進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)，從而根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)高低(正常、略差、較差、很差)建議個(gè)體化補(bǔ)充劑量。

近年來(lái)，不育不孕與新生兒出生缺陷發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，引起了醫(yī)療及政府相關(guān)部門的高度重視［7］。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心于2007年先后三次向全國(guó)婦幼保健院發(fā)出關(guān)于開(kāi)展“婦幼保健遺傳檢測(cè)服務(wù)項(xiàng)目”的函，指出:“為了提升婦幼保健服務(wù)的技術(shù)含量，將最新的預(yù)防檢測(cè)技術(shù)及時(shí)應(yīng)用于婦幼保健服務(wù)。”首期推出了以“孕期葉酸需求遺傳檢測(cè)”為代表的15項(xiàng)“婦幼保健遺傳檢測(cè)服務(wù)項(xiàng)目”。

目前，國(guó)內(nèi)部分省市雖然已經(jīng)有關(guān)于葉酸利用能力基因檢測(cè)個(gè)體化指導(dǎo)孕婦補(bǔ)充葉酸的相關(guān)報(bào)道，但還不夠系統(tǒng)和全面，特別是缺乏通過(guò)葉酸利用能力基因檢測(cè)孕齡女性分階段個(gè)體化補(bǔ)充葉酸全過(guò)程的跟蹤調(diào)查結(jié)果還尚無(wú)相關(guān)報(bào)道［8］。通過(guò)基因檢測(cè)技術(shù)手段，對(duì)人體MTHFR基因及MTRR基因做檢測(cè)，可以及早發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體對(duì)葉酸的吸收利用水平［9］，從而篩查出容易引起葉酸缺乏的高危人群，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化增補(bǔ)葉酸，同時(shí)加強(qiáng)產(chǎn)前檢查，以降低新生兒出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)［10］。因此，需要不斷開(kāi)展系列研究，特別是有關(guān)某些基因多態(tài)性的研究，有科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。

以上葉酸利用能力基因檢測(cè)結(jié)果顯示:觀察組的有不良孕產(chǎn)史組患者葉酸利用能力較差或很差所占比例明顯高于對(duì)照組的既往無(wú)不良孕產(chǎn)史患者(P＜0.05)。而對(duì)照組患者葉酸利用能力也存在明顯的個(gè)體差異。

因此，過(guò)去采用補(bǔ)充相同劑量的葉酸預(yù)防孕婦及新生兒缺陷性疾病有一定的局限性，建議圍孕期女性通過(guò)葉酸利用能力的遺傳基因檢測(cè)有針對(duì)性的調(diào)整葉酸補(bǔ)充劑量。

1 Lamb NE，Yu K，Shaffer J，et al.Association between mater-nalage and meioticre combination fortrisomy.Am J Hum Genet，2005，76:91.

2 Popiela A，Keith G，Borzecki A，et al.The meaning of themehylation of genomic DNA in the regulation of gene expres-sionlevels.Eur J Gynaecol Oncol，2004，25:145.

3 賀憲民，張群，楊琦，等.亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性研究.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2010，19:35-37.

4 鄭山，白亞娜，胡曉斌，等.孕產(chǎn)婦葉酸知曉途徑及其家人對(duì)服用葉酸影響.中國(guó)公共衛(wèi)生，2011，27:45-47.

5 張親鳳，林燕玲，薛燕燕，等.熒光定量PCR用于孕婦葉酸利用能力檢測(cè)研究.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2010，10:32-35.

6 何燕霞，鞏姣梅，沈勇，等.河南育齡女性葉酸利用能力現(xiàn)狀研究.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，2012，4:6-10.

7 陸云鳳.240例孕婦在孕前、孕早期葉酸服用情況的回顧性調(diào)查分析.中國(guó)婦幼保健，2006，21:19-21.

8 張春麗，張寧.2012年玉林市農(nóng)村適齡女性孕前和孕早期葉酸服用情況調(diào)查分析.包頭醫(yī)學(xué)，2014，38:95-97.

9 陳久霞，李岐佩，姚聰，等.406例圍孕期女性葉酸服用狀況調(diào)查.中國(guó)婦幼健康研究，2013，24:432-434.

10 徐亞男，吳艷喬，呂行，等.四川省孕期女性葉酸的認(rèn)知、服用狀況及影響因素分析.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40:3009-3011.