楊宏瓊，陸亞華，周志華，張尤歷，徐岷(常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州00;江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院;中國(guó)人民解放軍第0醫(yī)院)

人胃癌細(xì)胞株BGC-823克隆形態(tài)觀察及其CD44表達(dá)變化

楊宏瓊1，陸亞華1，周志華2，張尤歷3，徐岷3
(1常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州213003;2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院;3中國(guó)人民解放軍第101醫(yī)院)

摘要:目的觀察胃癌細(xì)胞株BGC-823的克隆形態(tài)，檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44在不同克隆形態(tài)中的表達(dá)。方法通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察BGC-823細(xì)胞的克隆形態(tài)并分類，計(jì)算克隆形成率及每種克隆所占比例，采用免疫熒光染色和Western blot法檢測(cè)不同克隆形態(tài)中CD44的表達(dá)情況。結(jié)果BGC-823細(xì)胞形成3種克隆形態(tài)，Holoclone、Meroclone和Paraclone型?？寺⌒纬陕蕿?.4%±1.1%，Holoclone型、Meroclone型和Paraclone型所占比例分別為9.8%、54.0%和36.2%。CD44在Holoclone型克隆中表達(dá)量最多。結(jié)論BGC-823細(xì)胞的克隆在形態(tài)和分化程度上存在差異，其中Holoclone型克隆可能富含胃癌干細(xì)胞。

關(guān)鍵詞:胃腫瘤;腫瘤干細(xì)胞;細(xì)胞克隆; CD44

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤中含有少量具有自我更新能力和分化潛能、并能產(chǎn)生耐藥的腫瘤細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)條件下，多種上皮癌細(xì)胞株存在形態(tài)不同的克隆，其中具有規(guī)則致密形態(tài)的Holoclone型克隆經(jīng)證實(shí)含有腫瘤干細(xì)胞［3，4］。2014年7月～2015年12月，我們觀察了胃癌細(xì)胞株BGC-823的克隆形態(tài)，并檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44在不同克隆形態(tài)中的表達(dá)，為研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料胃癌細(xì)胞株BGC-823購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;胎牛血清(FBS，Gibco)，胰酶(Sigma公司); Triton X100(Ameresco)，牛血清白蛋白(BSA)、DAPI(Sigma公司);克隆環(huán)(PYREX公司);兔多抗CD44、β-tubulin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，羊抗兔二抗(辣根酶標(biāo)記)、羊抗兔二抗(FITC標(biāo)記)購(gòu)自北京中杉金橋公司; CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，5% CO2、37℃培養(yǎng)。隔天換液1次，當(dāng)細(xì)胞匯合并鋪滿培養(yǎng)瓶底約80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞克隆形態(tài)觀察采用平皿克隆形成法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以500個(gè)/皿接種于直徑100mm的培養(yǎng)皿，共接種6個(gè)皿。靜置培養(yǎng)14d，動(dòng)態(tài)觀察標(biāo)記克隆形態(tài)并記錄細(xì)胞數(shù)。第14天顯微鏡下判斷細(xì)胞克隆形成，計(jì)算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，Giemsa染色。參照文獻(xiàn)［5］將克隆分為Holoclone、Meroclone和Paraclone 3型，計(jì)算不同類型克隆的比例。

1.2.3細(xì)胞克隆CD44陽(yáng)性檢測(cè)采用免疫熒光染色技術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)后以約300 個(gè)/皿的密度均勻接種于直徑為30mm的培養(yǎng)皿，共接種8個(gè)皿。靜置培養(yǎng)14d，隨機(jī)選擇5個(gè)皿(其他3個(gè)用于Western blot實(shí)驗(yàn))，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，BSA封閉。滴加一抗(CD44，1∶100)，4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗后滴加二抗(羊抗兔-FITC，1∶50)，37℃孵育1 h，PBS漂洗，DAPI(1∶100)染核，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果。在DAPI核定位染色藍(lán)色熒光強(qiáng)度相同的情況下，觀察CD44(FITC)的綠色熒光在Holoclone、Meroclone和Paraclone中的染色強(qiáng)度，比較不同克隆中CD44的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.4細(xì)胞克隆CD44表達(dá)量檢測(cè)采用Western blot方法。取上述培養(yǎng)第14天的3個(gè)培養(yǎng)皿，選5個(gè)Holoclone、Meroclone和Paraclone型克隆，在克隆環(huán)中消化細(xì)胞后，分別單獨(dú)接種于100mm培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)第12天，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗后對(duì)3種克隆進(jìn)行裂解，提取總蛋白，測(cè)蛋白濃度。

Paraclone型克隆由于細(xì)胞極少，所提蛋白量不足，將其舍棄。取BGC-823胃癌細(xì)胞蛋白作為對(duì)照。將蛋白樣品與6×Loading buffer按5∶1體積比混合，100℃水浴5min，離心后取上清。配制12%分離膠、5%濃縮膠，以50 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳。恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h，加一抗(兔抗人CD44，1∶1 000或β-tubulin，1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，TBS洗膜后分別加二抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶1 000)，37℃孵育1 h，洗膜后發(fā)光、顯影，以CD44與對(duì)應(yīng)內(nèi)參β-tubulin的灰度值之比作為各自的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以珋x±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞克隆生長(zhǎng)形態(tài)及克隆形成率細(xì)胞培養(yǎng)第1～2天，細(xì)胞呈單個(gè)均勻分布;第3天逐漸形成克隆;第5天發(fā)現(xiàn)有的克隆細(xì)胞體積大，有的則較小;第7～10天，不同克隆細(xì)胞在體積、細(xì)胞排列緊密程度及細(xì)胞數(shù)各方面區(qū)別明顯;第11～14天，不同克隆區(qū)別更加明顯。倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)，Holoclone型克隆形態(tài)規(guī)則，邊界平滑，細(xì)胞數(shù)目多，體積小，排列致密; Paraclone型克隆形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目少，體積大，排列松散;meroclone型克隆介于Holoclone和Paraclone型克隆之間。第14天，細(xì)胞克隆形成率為8.4%±1.1%，其中Holoclone、Meroclone和Paraclone型克隆所占比例分別為9.8%、54.0%和36.2%。

2.2細(xì)胞克隆CD44檢測(cè)結(jié)果CD44在Holoclone型克隆中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在Meroclone型克隆中的表達(dá)弱于Holoclone型克隆，在Paraclone型克隆中表達(dá)最弱。CD44在Holoclone、Meroclone型克隆和BGC-823胃癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.578±0.102，0.096 ±0.034，0.009±0.002，Holoclone型克隆表達(dá)量最多(P均＜0.05)。

3　討論

目前已證實(shí)，多種腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞，如前列腺癌［3］、胰腺癌［4］、急性白血?。?］、結(jié)腸癌［6］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［7］及乳腺癌［8］等。腫瘤干細(xì)胞可形成3種不同形態(tài)的克隆，分別稱為Holoclone、Meroclone 和Paraclone，其中Holoclone型克隆形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞排列緊密，具有腫瘤干細(xì)胞的特性。我們的前期研究［9］也有類似的結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用平皿克隆形態(tài)分離法，在胃癌細(xì)胞株BGC-823中發(fā)現(xiàn)了3種克隆形態(tài)，通過(guò)檢測(cè)CD44的表達(dá)情況比較不同克隆的分化特性，結(jié)果顯示CD44在Holoclone型克隆中表達(dá)最強(qiáng)。CD44是一種分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，屬于黏附分子家族，作為細(xì)胞表面組分與細(xì)胞外間質(zhì)相互作用，參與細(xì)胞的遷徙運(yùn)動(dòng)。CD44過(guò)表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、分期及耐藥等關(guān)系密切［10］。研究顯示，CD44是頭頸部鱗癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤干細(xì)胞的表面分子標(biāo)記物［11］。Takaishi等［12］研究認(rèn)為，CD44陽(yáng)性胃癌細(xì)胞可能是胃癌干細(xì)胞。因此推測(cè)，Holoclone型克隆可能富含胃癌干細(xì)胞，為下一步體內(nèi)外腫瘤干細(xì)胞的鑒定提供基礎(chǔ)與支持，對(duì)將來(lái)臨床中設(shè)計(jì)針對(duì)胃癌干細(xì)胞的靶向治療具有重要意義。

綜上所述，BGC-823細(xì)胞的克隆在形態(tài)和分化上存在差異，其中Holoclone型克隆可能富含胃癌干細(xì)胞。

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收稿日期:( 2015-01-11)

文章編號(hào):1002-266X(2015)34-0024-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R735.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.009