崔世紅，陳娟，孫俊燕，程國梅，杭中霞，李園園

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052）

胎膜早破即臨產(chǎn)前胎膜發(fā)生破裂，是產(chǎn)科常見的合并癥，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。胎膜早破發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與感染、凋亡有關(guān)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（TRAIL）能通過與其相應(yīng)的受體結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)死亡受體通路，可特異性地在體內(nèi)迅速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致胎膜組織結(jié)構(gòu)溶解，對(duì)維持胎膜完整性起重要作用。本研究觀察了胎膜早破產(chǎn)婦胎膜組織中TRAIL、MMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)變化，探討TRAIL、MMP-2與胎膜早破發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年6～11月因胎膜早破行剖宮產(chǎn)術(shù)結(jié)束妊娠的產(chǎn)婦30例（胎膜早破組），年齡（27.6 ±2.9）歲，孕周（38.9 ±1.3）周。隨機(jī)選取同期剖宮產(chǎn)分娩的健康產(chǎn)婦30例（對(duì)照組），年齡（27.4 ±1.1）歲，孕周（39.0 ±1.3）周。均無其他母體疾病、產(chǎn)科并發(fā)癥，剖宮產(chǎn)指征為胎位異常、骨盆狹窄等。兩組產(chǎn)婦年齡、孕周等資料具有可比性。兩組胎盤娩出后取胎膜破口處至胎盤邊緣的胎膜組織，約1 cm×4 cm，冷生理鹽水沖洗表面血跡，使其呈卷狀，用大頭針固定，分為兩部分，一部分放入凍存管后迅速投入液氮，一部分甲醛固定。

1.2 TRAIL、MMP-2蛋白檢測 采用免疫組化SP法。TRAIL、MMP-2主要定位于絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，呈黃棕色或棕褐色染色。根據(jù)染色程度及陽性細(xì)胞百分比綜合進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分:無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分;無陽性細(xì)胞計(jì)0分，陽性細(xì)胞百分比≤10%計(jì)1分，陽性細(xì)胞百分比11% ～50%計(jì)2分，51% ～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分;染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比得分相乘，＞3為陽性［2］。

1.3 TRAIL、MMP-2 mRNA 檢測 采用 real-time PCR法。采用TRIzol法提取胎膜組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，將GAPDH作為內(nèi)參基因，引物由上海生物工程有限公司合成。TRAIL上游引物序列為 5＇-AGAGGCACCACTAAAAGATCGC-3＇，下游引物序列為 5＇-GGTTTCACTATGTTGGTCACTATGG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物 133 bp;MMP-2上游引物序列為5＇-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3＇，下 游 引 物 序 列 為 5＇-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物280 bp;GAPDH上游引物序列為 5＇-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3＇，下游引物序列為 5＇-AGGGATGATGTTCTGGAGAG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物226 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃ 10 min;95℃ 30 s，60 ℃ 1 h，35 個(gè)循環(huán)，重復(fù) 3 次，以 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎膜組織中TRAIL、MMP-2蛋白表達(dá)比較 胎膜早破組胎膜組織中TRAIL表達(dá)陽性26例（87%）、MMP-2表達(dá)陽性23例（77%），對(duì)照組分別為17例（57%）、15例（50%）。兩組胎膜組織中TRAIL、MMP-2蛋白陽性表達(dá)率相比，P均＜0.05。

2.2 兩組胎膜組織中TRAIL、MMP-2 mRNA表達(dá)比較 胎膜早破組胎膜組織中TRAIL mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.62 ±0.18、MMP-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1.78 ± 0.54，對(duì)照組分別為 0.99 ± 0.17、1.03 ±0.49。兩組胎膜組織中 TRAIL、MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量相比，P均 ＜0.05。

3 討論

細(xì)胞增殖/凋亡平衡是胎盤發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。胎膜早破可能是多個(gè)基因調(diào)控、多種因素相互作用致胎膜細(xì)胞凋亡、降解的過程。有學(xué)者［3］發(fā)現(xiàn)足月妊娠產(chǎn)婦胎膜破裂后絨毛膜、羊膜破裂區(qū)附近有許多凋亡細(xì)胞，而在遠(yuǎn)離破裂區(qū)僅有少量凋亡細(xì)胞，認(rèn)為細(xì)胞凋亡與胎膜早破的發(fā)生有關(guān)［4］。

TRAIL/TRAIL受體系統(tǒng)參與整個(gè)妊娠期間胎盤、胎膜自我環(huán)境的穩(wěn)定［5］。TRAIL是腫瘤壞死因子家族的超家族成員之一。TRAIL共有5種受體，其中 DcR1、DcR2、OPG 為誘騙受體，DR4、DR5 為死亡受體［6］。DR4、DR5與 TRAIL結(jié)合后能激活凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過線粒體途徑及死亡受體途徑進(jìn)一步激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，最終引起細(xì)胞凋亡。Phillips等［3］發(fā)現(xiàn)胎盤、細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中均存在TRAIL及其受體的轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)外環(huán)境的影響，特別發(fā)生感染時(shí)，細(xì)胞因子分泌增多，上調(diào)TRAIL及其受體表達(dá)，使TRAIL/TRAIL受體系統(tǒng)平衡被打破，母胎界面免疫平衡發(fā)生紊亂，細(xì)胞凋亡及MMPs分泌增多，從而導(dǎo)致胎膜早破的發(fā)生。MMP-2可在人妊娠期胎膜連續(xù)表達(dá)［7］，調(diào)節(jié)胎膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分解代謝［8］。而MMP-2過高表達(dá)可加劇胎膜中的膠原降解，使胎膜脆性增加，胎膜強(qiáng)度及韌性降低，局部抗張能力下降，導(dǎo)致胎膜早破［9，10］。TNF-α 可增強(qiáng)胎膜組織中 MMPs基因的表達(dá)及活性，致使胎膜軟化和破裂［11］;炎癥因子分泌增多也可誘導(dǎo)或激活MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞胎膜膠原［12，13］。Sandig 等［14］發(fā)現(xiàn)胎膜早破產(chǎn)婦羊膜絨毛膜、胎盤的MMP-2基因的表達(dá)和活性增加也進(jìn)一步證明了這一觀點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，胎膜早破產(chǎn)婦組胎膜組織中TRAIL、MMP-2蛋白陽性表達(dá)率升高，TRAIL、MMP-2 mRNA 表達(dá)上調(diào)，與相關(guān)研究［15，16］結(jié)果一致。我們推測，TRAIL、MMP-2表達(dá)升高促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡和胎膜降解，這可能是胎膜早破發(fā)生的重要原因。

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