張冉，王全義，張軍臣，趙麗華，敖啟林

(1 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濟(jì)寧 272100;2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院)

膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在顱內(nèi)一般呈浸潤性生長，切除難度大;腦膠質(zhì)瘤治愈率低，復(fù)發(fā)率、致殘率及病死率高。胰島素樣生長因子ⅡmRNA結(jié)合蛋白3(IMP3)最初是在對比胰腺癌與正常胰腺的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)［1］，多傾向于在肺癌組織中表達(dá)［2］。Ki-67廣泛表達(dá)于增殖期細(xì)胞，是近年腫瘤增殖活動研究中較為精確、可靠的增殖期標(biāo)志物［3］。目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中關(guān)于 IMP3蛋白、Ki-67的表達(dá)研究不多。2012年10月～2013年6月，我們采用免疫組化Envision二步法檢測了腦膠質(zhì)瘤組織中IMP3蛋白及Ki-67表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本60份及正常腦組織5份。腦膠質(zhì)瘤患者中男42例、女18例，平均年齡40.1歲。所有切片經(jīng)兩名病理專業(yè)高級職稱醫(yī)師共同診斷，其中節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤3例，毛細(xì)胞星型細(xì)胞瘤2例，彌漫型星型細(xì)胞瘤21例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤15例，間變型室管膜細(xì)胞瘤4例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤15例。組織學(xué)分級為Ⅰ級5例、Ⅱ級20例、Ⅲ級20例、Ⅳ級15例。

1.2 腦膠質(zhì)瘤組織中IMP3蛋白及Ki-67檢測 采用免疫組化Envision二步法。石蠟切片，厚4 μm，將石蠟組織片貼附于防脫多聚賴氨酸載玻片上，置于60℃烤箱中烤片1 h，取出備用。石蠟切片脫蠟，將切片置于3%過氧化氫中，10 min后取出，PBS沖洗3次，每次5 min。對組織抗原進(jìn)行修復(fù)，取一定量EDTA緩沖液(pH=9.0)于抗原修復(fù)盒中，將組織切片置于塑料切片架上，微波爐中火修復(fù)10 min，取出，冷卻至室溫。之后用PBS洗3次，每次5 min。甩去切片PBS液，每張切片加50 μL IMP3(1∶50稀釋)，37℃下靜置1 h。用PBS液沖洗3次，每次5 min。甩去切片PBS液，每張切片加Envision DAB-A 50 μL，37℃烤箱中靜置30 min或室溫下靜置1 h。PBS液沖洗3次，每次5 min。甩去切片PBS液，每張切片加100 μL DAB顯色劑工作液。鏡下觀察3～10 min，陽性顯色為棕黃色顆粒。用蒸餾水沖洗10 min，蘇木素復(fù)染2 min，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗10～15 min。脫水，透明，封片，鏡檢。

IMP3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。未見著色細(xì)胞為-;著色細(xì)胞數(shù)＜25%為+;著色細(xì)胞數(shù)占25%～50%為++;著色細(xì)胞數(shù)＞50%為+++。+、++、+++判為陽性。Ki-67蛋白表達(dá)以細(xì)胞核內(nèi)呈棕色或棕黃色染色為陽性。一般采用Ki-67指數(shù)表示細(xì)胞的增殖程度，高倍鏡 (×400)下每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞，計(jì)算其陽性細(xì)胞所占百分比。著色細(xì)胞＜5%為陰性-;著色細(xì)胞數(shù)5%～10%為弱陽性+;著色細(xì)胞數(shù)11%～25%為中度陽性++;著色細(xì)胞數(shù)＞25%為強(qiáng)陽性+++。+、++、+++判為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。χ2檢驗(yàn)分析IMP3蛋白和Ki67在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，采用Spearman等級相關(guān)分析法對IMP3蛋白和Ki67的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IMP3蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) IMP3蛋白在正常腦組織中無表達(dá)，在膠質(zhì)瘤組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，-、+、++、+++者分別為26、8、11、15份，陽性表達(dá)率為 56.7%，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中IMP3蛋白陽性表達(dá)率分別為0、10%、90%、93%，IMP3蛋白在膠質(zhì)瘤各級別組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.17，P ＜0.05)。

2.2 Ki-67在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 正常腦組織中未見Ki-67陽性表達(dá)，膠質(zhì)瘤組織中Ki-67表達(dá)于細(xì)胞核，-、+、++、+++者分別為 23、26、9、2份，陽性表達(dá)率為61.7%，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率分別為0、25%、90%、93%，Ki-67蛋白在膠質(zhì)瘤各級別組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.17，P ＜0.05)。

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織中IMP3與Ki-67表達(dá)的關(guān)系腦膠質(zhì)瘤組織中IMP3蛋白陽性表達(dá)與Ki-67蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.774，P ＜0.05)。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長，由于血腦屏障的特殊結(jié)構(gòu)，一般化療藥物療效不顯著。高級別的膠質(zhì)瘤，具有高度間變的生長特點(diǎn)，術(shù)后復(fù)發(fā)快，預(yù)后差。腫瘤細(xì)胞的惡性程度與其增殖能力及誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜的能力有關(guān)。

IMP3是一個(gè)由580個(gè)氨基酸組成的癌胚RNA結(jié)合蛋白，含有4個(gè)K同源結(jié)構(gòu)域，由7號染色體短臂11.5的IGF2BP3基因編碼，由一個(gè)4350 bp的mRNA轉(zhuǎn)錄而成。該蛋白的相對分子質(zhì)量為65～70 kD，其在胚胎形成時(shí)調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)IGF-Ⅱ表達(dá)，而在肝癌和癌旁組織中均有 IGF-Ⅱ異常表達(dá)［4］，IGF-Ⅱ基因高表達(dá)可能不僅與IGF基因的異常表達(dá)有關(guān)，亦與IMP3異常調(diào)控有關(guān)。IMP3促進(jìn)IGF-ⅡmRNA的翻譯，進(jìn)而增加IGF-Ⅱ水平。而IGF-Ⅱ和細(xì)胞表面的受體(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ受體)結(jié)合，產(chǎn)生胞質(zhì)內(nèi)循環(huán)短路，放大了細(xì)胞持續(xù)生長信號的傳遞，加速了腫瘤細(xì)胞的增殖，維持其惡性表型［4，5］。Findeis-Hosey等［6］報(bào)道，小鼠IMPS家族基因缺失可使CD44mRNA表達(dá)下調(diào)［6］。而IMP3能間接通過CD44和基質(zhì)金屬蛋白酶等途徑參與腫瘤惡性生物行為［7］。

Ki-67是評價(jià)腫瘤增殖程度的較好指標(biāo)，由兩條多肽鏈組成，相對分子質(zhì)量分別為345、395 kD，定位于第10號染色體的長臂。Ki-67在增殖期細(xì)胞特異性表達(dá)，半衰期較短，其陽性表達(dá)覆蓋整個(gè)有絲分裂期，受背景干擾較小，能反映腫瘤的惡性程度及患者預(yù)后［8，9］。

本研究結(jié)果顯示，IMP3蛋白主要表達(dá)于高級別的膠質(zhì)瘤組織中，且其表達(dá)率隨著組織分級的增加而增加，提示其可能通過調(diào)節(jié)IGF-Ⅱ、CD44、基質(zhì)金屬蛋白酶等參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長過程;Ki-67在高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ～Ⅳ級)中的陽性表達(dá)率明顯高于低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ～Ⅱ級)，提示隨著膠質(zhì)瘤的級別及惡性程度的增高，腫瘤細(xì)胞的增殖能力增加。

綜上所述，IMP3及Ki-67在腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，且與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)，二者可作為評價(jià)膠質(zhì)瘤級別的重要指標(biāo)。

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