潘起晨，王明昊，班允超，崔曉，王運杰(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

Diversin在人腦星形細胞瘤組織中的表達及其對腫瘤細胞增殖和侵襲的影響

潘起晨，王明昊，班允超，崔曉，王運杰
(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

摘要:目的觀察人腦星形細胞瘤組織中Diversin表達及其對腫瘤細胞增殖和侵襲的影響，并探討其作用機制。方法采用免疫組化法檢測105例人腦星形細胞瘤組織中的Diversin。通過siRNA沉默技術(shù)調(diào)控星形細胞瘤U87細胞中Diversin的表達，并以MTT、Transwell、Western blot、實時熒光定量PCR等方法檢測腫瘤細胞的增殖和遷移能力及細胞Diversin、p-JNK、MMP-9的表達。結(jié)果Diversin在星形細胞瘤的組織學分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級中的表達陽性率分別為0、19.2%、48.9%，P均＜0.01。對照組與干擾組U87細胞增殖指數(shù)分別為2.01±0.42、1.62±0.14，P＜0.05;穿膜細胞數(shù)分別為(57±6)、(39±6)個，P＜0.05; Diversin、p-JNK、MMP9 mRNA及蛋白表達均下降，P均＜0.05。結(jié)論Diversin可隨星形細胞瘤組織學分級而升高，可作為判斷其生物學行為的標記物; Diversin能夠通過JNK途徑促進人腦星形細胞瘤的增殖與侵襲，并可能成為治療該腫瘤的新靶點。

關(guān)鍵詞:錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白;免疫組織化學;神經(jīng)膠質(zhì)瘤;生物學行為

星形細胞瘤的預后除與腫瘤發(fā)生部位、大小、組織學類型和分級有關(guān)外，也與腫瘤細胞的生物學行為(增殖、侵襲等)密切相關(guān)［1，2］。Diversin又稱錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白6(ANKRD6)，是果蠅屬Diego蛋白在哺乳動物中的同源異構(gòu)體［3］。研究表明，Diversin在小鼠神經(jīng)母細胞和成熟的神經(jīng)元細胞中有表達，且能夠促進神經(jīng)母細胞的增殖［4］。但是，其在正常的膠質(zhì)細胞和星形細胞瘤中的表達情況及作用仍不清楚。本研究檢測了人腦星形細胞瘤組織中Diversin的表達，分析其與臨床病理因素之間的關(guān)系;通過siRNA調(diào)控腫瘤細胞中Diversin的表達，觀察其對膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲的影響，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料2007～2012年中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的人腦星形細胞瘤組織蠟塊105例，患者中男63例，女42例;年齡35～70歲，平均53.4歲?；颊咝g(shù)前均未行放化療，病理診斷和分型(分級)參照2003 WHO標準，研究獲得了倫理委員會的同意及許可。

1.2方法

1.2.1人腦星形細胞瘤組織中Diversin表達檢測

采用免疫組化法。將石蠟組織塊切成4 μm厚的切片，脫蠟、脫水，按S-P法和抗體說明操作。一抗:小鼠抗人單克隆抗體Diversion(1∶150，Santa Cruz Biotechnology，USA)，以PBS為空白對照。選腫瘤細胞陽性染色集中區(qū)域，每張切片計數(shù)400個腫瘤細胞，由兩名病理醫(yī)師雙盲觀測。Diversion陽性表達位于細胞核。按陽性細胞百分率分為陰性(＜5%)、陽性(5%～25%)、強陽性(≥26%)［5］。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染選擇ATCC細胞庫星形細胞瘤U87細胞(Manassas，USA)，用含10%熱滅活新鮮小牛血清DMEM(Invitrogen，USA)、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)待用。轉(zhuǎn)染前24 h將細胞按50%密度接種于24孔板。質(zhì)粒: ON-TARGETplus diversin siRNA 和ON-TARGETplus Non-Targeting siRNA購自Dharmacon公司(USA)。轉(zhuǎn)染試劑: DharmaFECT1(Qiagen，USA)。同時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對照。轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blot方法檢測干擾效率。

1.2.3細胞增殖觀察采用MTT法。將單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL含1× 103個細胞，培養(yǎng)24 h;每孔加入MTT(5 mg/mL，Sigma，USA)培養(yǎng)4 h，吸去上清液;加入150 μL DMSO(Sigma，USA)，振蕩10 min; 490 nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細胞生長曲線，計算增殖指數(shù)(PI)。

1.2.4細胞侵襲能力觀察采用Transwell細胞侵襲實驗［6］。用預冷無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶5稀釋Matrigel(BD Biosciences，USA)，將轉(zhuǎn)染24 h后的細胞制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3×105/mL，取100 μL加入上室(孔徑8 μm，Costar，USA)，下室加600 μL含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基。37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)18 h后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗后以甲醇室溫固定15 min;用棉簽輕擦掉上表面的細胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，至載玻片上，鏡下計數(shù)細胞數(shù)，實驗重復3次，取均值。

1.2.5Diversin、P-JNK、MMP-9蛋白檢測采用Western blot法。收集培養(yǎng)細胞，加入裂解液充分裂解; 4℃下12 000 r/min離心30 min，提取上清。上樣蛋白60 μg，電泳(12% SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印(50 V，120 min)，5%正常小牛血清封閉。一抗:小鼠抗人單克隆抗體Diversin(1∶500，Santa Cruz)、MMP9、p-JNK(1∶1 000，Cell Signaling)、內(nèi)參GAPDH(1∶2 000，Santa Cruz)。4℃孵育過夜，分別與對應(yīng)的二抗(1∶2 500，Santa Cruz，USA)室溫孵育2 h，ECL顯色并采集圖像;測定灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值。

1.2.6Diversin、P-JNK、MMP-9 mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，使用TRIzol試劑提取RNA，采用ABI high capacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)進行反轉(zhuǎn)錄。使用ABI7900實時定量PCR儀，內(nèi)參采用β-actin。定量PCR反應(yīng)條件: 95°C 30 s，95°C 5 s，40個循環(huán)，60 ℃30 s。Diverxin上游引物為5'-CCCCTAAGAGATCCTTCAGCAG-3'，下游引物為5'-CCACACGCTGTCAGAGGATG-3'; p-JNK上游引物為5'-GCTGGAGGTCTGCGAGGA-3'，下游引物為5'-ACAGGAAGCGGTCCAGGTAGT-3'; MMP9上游引物為5'-ACGGTGGTGGAGGAGCTCTT-3'，下游引物為5'-CGGTTGACGCTCTCCACAC-3';β-actin上游引物為5'-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3'，下游引物為5'-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'。以2－ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。

1.2.7統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1Diversin在人腦星形細胞瘤組織中的表達105例患者中，Diversin陽性表達33例。其中，組織學分級Ⅰ級的星形細胞瘤Diversin表達陽性率為0(0/6)，Ⅱ級為19.2%(10/52)，Ⅲ～Ⅳ級為48.9%(23/47)，P均＜0.01。見插頁Ⅱ圖5。

2.2干擾Diversin對U87細胞增殖和侵襲的影響

轉(zhuǎn)染特異性siRNA后U87細胞Diversin的mRNA和蛋白表達均明顯下降，干擾效率為69.5%。對照組與干擾組U87細胞PI分別為2.01±0.42、1.62 ±0.14，P＜0.05;穿膜細胞數(shù)分別為(57±6)、(39 ±7)個，P＜0.05。見插頁Ⅱ圖6。

2.3干擾Diversin對U87細胞Diversin、p-JNK和MMP-9表達的影響見表1。

表1　兩組U87細胞Diversin、p-JNK、MMP-9表達比較(±s)

組別蛋白對照組　0.82±0.21　0.18±0.02　0.96±0.15　0.17±0.04　0.9 Diversin mRNA 蛋白p-JNK mRNA 蛋白MMP-9 mRNA 2±0.21　0.19±0.07干擾組　0.25±0.05　0.14±0.03　0.51±0.13　0.12±0.01　0.37±0.08　0.12±0.03 t 11.870　4.332　5.125　8.721　8.773　12.432 P ＜0.001　0.017　0.021　0.008　0.018?。?.001

3　討論

目前，對Diversin在腫瘤中的作用及機制研究尚少［7］。Diversin在胚胎發(fā)育過程中可抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路，同時可激活非經(jīng)典的Wnt/PCP通路［8，9］，而Wnt通路與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Makiko等［4］發(fā)現(xiàn)，在新生小鼠和成鼠腦內(nèi)，Diversin表達于室下區(qū)和海馬區(qū)的神經(jīng)母細胞和成熟神經(jīng)元，并對其生物學行為具有一定影響。本研究結(jié)果顯示，Diversin表達主要存在與細胞核中，且與腫瘤組織學分級密切相關(guān)。

動物實驗證實，Diversin可促進小鼠神經(jīng)母細胞增殖和遷移［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過程中Diversin調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎的原腸胚運動以及控制心臟前體的融合是通過非經(jīng)典Wnt/JNK通路實現(xiàn)的［7］。該研究認為，Diversin轉(zhuǎn)移入核后可以和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AF9相互作用，進而促進JNK活性。在人胚腎293細胞系中，Diversin和Dishevelled的表達可以協(xié)同增強JNK的活性［11］。因此，推測Diversin促進星形細胞瘤的增殖和侵襲的能力與其激活JNK通路有關(guān)［12］。本研究利用基因沉默技術(shù)干擾Diversin表達后，U87細胞增殖和侵襲能力受到明顯抑制;同時發(fā)現(xiàn)，Wnt/PCP通路中的關(guān)鍵因子p-JNK及其下游靶因子MMP-9、mRNA和蛋白表達降低。以往研究顯示，MMP9參與癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［13］，其表達降低將抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生長［14，15］;而JNK活化后可通過調(diào)控Cdc25c基因而導致細胞周期異常［16］?？梢姡珼iversin發(fā)揮其促進星形細胞瘤增殖和侵襲能力與其激活JNK通路有密切關(guān)系。因此，Diversin可作為星形細胞瘤生物學行為的標記物，并可能成為治療該腫瘤的新靶點。

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Expression of Diversin in human astrocytomas and its relationships with proliferation and invasion of tumor cells

PAN Qi-chen，WANG Ming-hao，BAN Yun-chao，CUI Xiao，WANG Yun-jie
(The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China)

Abstract:Objective To observe the expression of Diversin in human astrocytomas and its relationships with proliferation and invasion of tumor cells，and to investigate its mechanism.Methods The expression of Diversin was detected by immunohistochemical method in 105 cases of astrocytoma tissues.Small interfering RNA(siRNA) knockdown was performed in U87 cell line to regulate the Diversin expression.MTT，Transwell，Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the cell proliferation and migration ability as well as the expression of Diversin p-JNK and MMP-9.Results The positive expression rates of Diversin in the histological gradeⅠ，ⅡandⅢof astrocytoma were 19.2% and 48.9%(all P＜0.01).The proliferation indexes of U87 cells in the control and interference groups were 2.01 ±0.42 and 1.62±0.14(P＜0.05)，and the cells moved through the membrane were(57±6) and(39±6)(P＜0.05).The protein and mRNA expression of Diversin p-JNK and MMP9 was significantly decreased(all P＜0.05).Conclusions Diversin increases with the increased histological grades of astrocytoma and it may be used as the biological behavior marker of astrocytomas.Meanwhile，Diversin can promote the proliferation and invasion of astrocytomas by the way of JNK，and thus it can be a new target for treatment of the tumor.

Key words:Diversin; immunohistochemistry; glioma; biological behavior

(收稿日期:2014-10-09)

通信作者簡介:王運杰(1955-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。E-mail: wyj023@ vip.sina.com.cn

作者簡介:第一潘起晨(1982-)，男，住院醫(yī)師，主要研究方向為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。E-mail: panqichen@163.com

基金項目:遼寧省自然科學基金資助項目(2014021066)。

文章編號:1002-266X(2015) 20-0004-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R739.4

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.002