王賁士，喬錄新，張玉林，封曉昆，陳德喜，郭洪亮(山東省腫瘤醫(yī)院，濟南2507;2濟南大學山東醫(yī)學科學院與生命科學學院; 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院)

線粒體tRNAleu區(qū)突變與腫瘤的發(fā)生及p53突變的關系

王賁士1，2，喬錄新3，張玉林3，封曉昆1，2，陳德喜3，郭洪亮1
(1山東省腫瘤醫(yī)院，濟南250117;2濟南大學山東醫(yī)學科學院與生命科學學院; 3首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院)

摘要:目的研究腫瘤患者線粒體DNA(mtDNA)中tRNAleu區(qū)序列3264位點上T→C突變與腫瘤發(fā)生及p53突變的關系。方法提取接受手術治療的28例肝癌及35例結腸癌患者的癌組織與癌旁組織總DNA，采用PCR法擴增mtDNA中的tRNAleu區(qū)以及p53基因全長并測序。結果所有癌組織中未見3264位點T→C的突變，但有16例在其他位點發(fā)現(xiàn)了突變;所有癌旁組織中未見3264位點T→C的突變，有3例在其他位點發(fā)生突變。在癌組織中發(fā)現(xiàn)17例p53基因突變;結腸癌組織p53突變9例，其中存在tRNAleu區(qū)突變6例、無tRNAleu區(qū)突變3例，P＜0.05;肝癌組織p53突變8例，其中存在tRNAlen區(qū)突變5例，無tRNAlen區(qū)突變3例，P＜0.05。結論tRNAleu區(qū)3264位點上T→C的突變暫不能認為與腫瘤的發(fā)生存在直接關系，該區(qū)域其他位點的突變可能是由于p53突變后喪失對該基因的保護而繼發(fā)產生的。

關鍵詞:結腸癌;肝癌;線粒體; p53; tRNAleu區(qū)序列;突變

tRNAleu是線粒體重要的片段之一，該區(qū)域相關位點的突變與糖尿病、糖尿病型耳聾等代謝性疾病有著明顯的聯(lián)系［1］。近來有文獻報道［2］，tRNAL-eu基因3264位點T→C的突變不僅能夠引起糖尿病患者產生母系遺傳性糖尿病，而且患者易患多發(fā)性腫瘤。但是，該位點突變與腫瘤發(fā)病的相關性國內尚無報道。因此，我們通過對腫瘤患者癌組織與癌旁組織tRNALeu序列的擴增比對，探討該區(qū)3264位點突變與腫瘤發(fā)生的關系;同時，擴增癌組織中的p53全長序列，分析其與p53突變之間的關系。

1　資料與方法

1.1臨床資料2010年7月～2011年1月山東省腫瘤醫(yī)院接受結腸癌手術治療的結腸癌患者35例。其中男20例、女15例，年齡45～64(56±2.6)歲，符合衛(wèi)生部2010年頒布的《結腸癌規(guī)范化診療指南(試行)》中的診斷標準。2011年9月～2013年8月北京佑安醫(yī)院接受肝癌切除術的肝癌患者28例。其中男17例、女11例，年齡47～61(54±2.6)歲，符合衛(wèi)生部2011年頒布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中的診斷標準?；颊呔涍^術前取組織病理活檢及術后腫瘤組織病理檢查確診為結腸癌以及肝癌，均以癌旁正常組織作為對照。該研究樣本均無特殊病例，體檢也無異常發(fā)現(xiàn)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取取適量的癌組織以及癌旁組織，加入研磨器中;立即加入少量液氮，迅速研磨?；蚪MDNA的提取，按照DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)的說明書進行。

1.2.2tRNAleu、p53序列的擴增及序列分析設計合成tRNAleu序列擴增引物，上游引物為5'-AAGGTTCGTTTGTTCAACGA-3'，下游引物為5'-GGCCTAGGTTGAGGTTGACC-3'。PCR擴增反應體系:10×緩沖液5 μL，脫氧核苷三磷酸(Dntp) 4 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸餾水36.5 μL;反應條件: 94℃2 min，94℃20 s，50℃30 s，72℃90 s，35個循環(huán)，72℃10 min。p53基因全長擴增引物: p53 S 121為ATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT，p53 as 1302為TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG。PCR擴增反應體系: 94℃5 min，94℃20 s，55℃30 s，72℃120 s，35個循環(huán)，72℃10 min。取擴增產物5 μL，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳(120 V 10 min)，Tanon 1600R型凝膠成像儀成像分析。反應產物送北京博邁德生物技術有限公司完成純化和測序，測序引物同PCR引物。測序結果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed比對進行序列來源鑒定。并逐一比對報告相關突變位點。

1.2.3統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。兩組樣本率的比較采用校準χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1線粒體DNA tRNAleu序列PCR擴增結果線粒體DNA tRNAleu序列擴增條帶清晰，陰性對照目標區(qū)無擴增條帶(插頁Ⅱ圖7)，測序結果堿基峰清晰。在比對后和人的線粒體DNA中tRNAleu序列相似度最高，確認擴增片段為DNA tRNAleu區(qū)序列。p53基因PCR擴增電泳圖(部分)及測序峰圖見插頁Ⅲ圖8。

2.2癌組織與癌旁組織tRNAleu區(qū)堿基序列突變比較患者均未發(fā)現(xiàn)3264位點上T→C突變。結腸癌組織tRNAleu區(qū)其他位點突變10例，癌旁組織2例，突變率比較，P＜0.05。肝癌組織tRNAleu區(qū)其他位點突變6例，癌旁組織1例，突變率比較，P＜0.05。

2.3癌組織p53有效突變位點統(tǒng)計癌組織中發(fā)現(xiàn)17例p53基因突變;結腸癌組織p53突變9例，其中tRNAleu區(qū)突變6例，無tRNAleu區(qū)突變3例，P＜0.05;肝癌組織p53突變8例，其中tRNAleu區(qū)突變5例，無tRNAleu區(qū)突變3例，P＜0.05。

3　討論

mtDNA缺乏組蛋白保護和有效的損傷修復系統(tǒng)，又處于線粒體的高氧化自由基環(huán)境中，容易出現(xiàn)功能結構和含量的改變［3～10］。tRNA盡管只占線粒體基因組的10%，但其突變所導致的疾病占所有疾病mtDNA突變的50%，可見其在人類疾病中的重要性［11］。其中，線粒體tRNAleu則通過一個尚未明確的機制與大量的人類疾病存在聯(lián)系［12］。最近的研究表明，mtDNA突變不斷積累在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［13～16］。因此，專家們懷疑腫瘤患者中線粒體功能障礙是由于mtDNA的3264位點突變誘導了與腫瘤發(fā)生有關的氧化應激，或使腫瘤細胞Caspase級聯(lián)反應紊亂［14，15］。

本研究未在肝癌、結腸癌組織線粒體DNA tRNAleu區(qū)發(fā)現(xiàn)3264位點上的T→C突變。因此，我們尚且認為文獻中所報道的病例是個案特例，暫不能證明3264位點上的T→C突變與結腸癌、肝癌的發(fā)病存在直接關系。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)該區(qū)域還存在其他位點的突變，研究顯示該區(qū)域相關位點的突變與家族性糖尿病有關［11］。但是，根據(jù)相應患者的病例資料未發(fā)現(xiàn)該區(qū)突變相關的遺傳性疾病。同時，我們將癌組織與癌旁組織對比發(fā)現(xiàn)，癌組織的突變率明顯高于癌旁組織。根據(jù)以上兩點我們可以推測該區(qū)域的突變可能是在腫瘤發(fā)生后的繼發(fā)性突變［16］。眾所周知，腫瘤的發(fā)生與p53基因的突變有關，文獻報道p53的5、6、7、8外顯子為其高突變區(qū)且與腫瘤的發(fā)生有著密切聯(lián)系［12］。p53對腫瘤的抑制起到核心作用，在細胞凋亡、細胞周期調控DNA修復中同樣也起到中心作用［2］。同時，p53突變也對腫瘤的預后與轉移有影響，如大腸癌的肝轉移［12］。據(jù)文獻報道［2］，p53不僅能夠維持細胞核DNA的穩(wěn)定，同時對線粒體DNA的穩(wěn)定性也有重要作用。在線粒體中，p53蛋白參與到蛋白的轉錄及復制的調節(jié)中，并且維持基因的穩(wěn)定性。p53蛋白在線粒體中能夠觸動線粒體的凋亡，p53的抑制將會使能量代謝從線粒體呼吸切換到有氧糖酵解，從而使腫瘤生長于低氧環(huán)境。最新研究表明［17］，線粒體基因的穩(wěn)定性通過p53定位于線粒體，并刺激線粒體的單堿基切除修復通路來維持。在各種刺激下，P53能夠與線粒體內的DNA聚合酶γ相互作用，繼而啟動堿基切除修復，切除損傷基因和嘌呤、嘧啶位點，糾正線粒體DNA上的突變，從而使線粒體DNA維持穩(wěn)定［3］。也有研究認為，p53綁定區(qū)域與線粒體16srDNA區(qū)域結合，該區(qū)域的任何變化(例如R273H)都可能使DNA的綁定結合，妨礙mtDNA的轉錄和復制［4］。當結腸癌組織中的p53基因發(fā)生突變，p53基因不能正常表達p53蛋白時，則進一步影響到p53蛋白以及其下游蛋白的對線粒體DNA的保護功能，從而使其突變率升高［13，18］。因此，我們對該標本又進一步擴增了p53的全長。結果顯示，25.7%的結腸癌患者存在p53突變，同時有28.5%的肝癌患者存在p53突變。將兩者的p53突變與tRNAleu區(qū)突變做對比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，故而我們初步推測p53突變與tRNAleu區(qū)的突變存在關系。tRNAleu區(qū)域的突變與細胞的代謝存在重要關系［5，19］，因此，研究腫瘤組織內該區(qū)域的高突變率可能對腫瘤細胞的代謝以及腫瘤患者的預后有重要意義。

綜上所述，mtDNA上tRNAleu區(qū)內3264位點上T→C的突變暫不能認為其與腫瘤發(fā)生存在直接關系。該區(qū)域在癌組織內的突變率明顯高于癌旁組織，其很可能與癌組織中的p53突變有關，具體這些突變與p53突變的相互作用機制以及對癌癥患者預后的影響還需要進一步研究。

參考文獻:

［1］Suzuki Y，Suzuki S，Taniyama M，et al.Multiple tumors in mitochondrial diabetes associated with tRNALeu(UUR) mutation at position 3264［J］.Diabetes Care，2003，26(6) : 1942-1943.

［2］Chen D，Yu Z，Zhu Z，et al.The p53 pathway promotes efficient mitochondrial DNA base excision repair in colorectal cancer cells ［J］.Cancer Res，2006，66(7) : 3485-3494.

［3］Achanta G，Sasaki R，F(xiàn)eng L，et al.Novel role of p53 in maintaining mitochondrial genetic stability through interaction with DNA Pol γ［J］.EMBO J，2005，24(19) : 3482-3492.

［4］Heyne K，Mannebach S，Wuertz E，et al.Identification of a putative p53 binding sequence within the human mitochondrial genome ［J］.FEBS Lett，2004，578(1-2) : 198-202.

［5］Ruiz-Pesini E，Lott MT，Procaccio V，et al.Anenhanced MITOMAP with a global mtDNA mutational phylogeny［J］.Nucleic Acids Res，2007，35: D823-828.

［6］Yarham JW，Elson JL，Blakely EL，et al.Mitochondrial tRNA mutations and disease［J］.Wiley Interdiscip Rev RNA，2010，1(2) : 304-324.

［7］Tsutomu S，Asuteka N，Takeo S.Human mitochondrial diseases caused by lack of taurine modification in mitochondrial tRNAs［J］.Wiley Interdiscip Rev RNA，2011，2(3) : 376-386.

［8］Suzuki T，Nagao A，Suzuki T.Human mitochondrial tRNAs: biogenesis，function，structural aspects，and diseases［J］.Annu Rev Genet，2011，45: 299-329.

［9］Sasarman F，Antonicka H，Shoubridge EA.The A3243G tRNAL-eu(UUR) MELAS mutation causes amino acid misincorporation and a combined respiratory chain assembly defect partially suppressed by overexpression of EFTu and EFG2［J］.Hum Mol Genet，2008，17(23) : 3697-3707.

［10］孫玉蘭，胡義德.線粒體DNA與腫瘤關系的研究進展［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13(12) : 951-955.

［11］杜云峰，沈默宇，成金羅，等.家族性糖尿病中線粒體tRNALeu(UUR)基因突變的研究［J］.臨床薈萃，2010，25(10) : 901-903.

［12］王向昱，張建新，李利義，等.大腸癌K-ras、p53基因突變分析及其與肝轉移的關系［J］.肝膽胰外科雜志，2010，22(1) : 50-52.

［13］Wu Y，Li N，Zhang T，et al.Mitochondrial DNA base excision repair and mitochondrial DNA mutation in human hepatic HuH-7 cells exposed to stavudine［J］.Mutat Res，2009，664(1-2) : 28-38.

［14］Wei YH，Lee HC.Oxidative stress，mitochondrial DNA mutation，and impairment of antioxidant enzymes in aging［J］.Exp Biol Med，2002，227(9) : 671-682.

［15］Duraisamy P，Elango S，Vishwanandha VP，et al.Prevalence of mitochondrial tRNA gene mutations and their association with specific clinical phenotypes in patients with type 2 diabetes mellitus of Coimbatore［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2010，14(1) : 49-55.

［16］Marín-García J.Diabetes and Cardiac Mitochondria［M］.New York.Springer US，2013: 387-399.

［17］Vaseva AV，Moll UM.Identification of p53 in Mitochondria［M］.New York: Humana Press，2013: 75-84.

［18］Goh AM，Coffill CR，Lane DP.The role of mutant p53 in human cancer［J］.J Pathol，2011，223(2) : 116-126.

［19］Wang S，Wu S，Zheng T，et al.Mitochondrial DNA mutations in diabetes mellitus patients in Chinese Han population［J］.Gene，2013，531(2) : 472-475.

Relationships of mitochondrial tRNAleu mutations with tumorigenesis and p53 mutation

WANG Ben-shi1，QIAO Lu-xin，ZHANG Yu-lin，F(xiàn)ENG Xiao-kun，CHEN De-xi，GUO Hong-liang
(1 Tumor Hospital of Shandong Province，Jinan 250117，China)

Abstract:Objective To investigate the relationships of T→C mutation of 3264 site in tRNAleu region of mitochondrial DNA(mtDNA) with tumorigenesis and p53 mutation.Methods The whole DNA was extracted from carcinoma and adjacent tissues of 28 patients with liver carcinoma and 35 patients with colon cancer.Then tRNAleu region of mtDNA and p53 gene were amplified by PCR and sequenced.Results No T→C mutation was found in 3264 site，but 16 cases of mutations in the other sites were discovered in the carcinoma tissues.No T→C mutation was found in 3264 site，but 3 cases of mutations were discovered in the adjacent tissues.Seventeen cases of p53 gene mutation were found in the carcinoma tissues; 9 cases of p53 mutation were found in patients with colon carcinoma，including 6 cases of tRNAleu mutation and 3 cases of non-tRNAleu mutation(P＜0.05) ; and 8 cases of p53 mutation were found in patients with liver cancer，including 5 cases of tRNAleu mutation and 3 cases of non-tRNAleu mutation(P＜0.05).Conclusions The T→C mutation in 3264 site of tRNAleu region can't be considered to have relationship with tumorigenesis.The mutations in other sites of tRNAleu region are due to p53 mutation，so the gene loses its protection，and thus the mutation occurs.

Key words:colonic carcinoma; liver carcinoma; mitochondria; p53; sequence of tRNAleu region; mutation

(收稿日期:2014-06-17)

通信作者簡介:郭洪亮(1963-)，男，主任醫(yī)師，研究員，主要研究方向為大腸癌及胃癌的基礎與臨床。E-mail: hliangbb@163.com

作者簡介:第一王賁士(1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向為大腸癌的基礎與臨床。E-mail: wangbishi1521@163.com

基金項目:國家十二五重大專項(2012ZX10001004-002) ;國家科技支撐計劃課題(2012BAI15B00) ;“十二五”艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(2012ZX10001-003-003) ;山東省醫(yī)學科學院級科技計劃(2014-24)。

文章編號:1002-266X(2015) 20-0007-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R73; Q343.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.003