李婷婷劉 陽(yáng)蘇永超杜立銀②*（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 內(nèi)蒙古通遼 028000 ②內(nèi)蒙古高校毒物與動(dòng)物疾病監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 內(nèi)蒙古 通遼）

文獻(xiàn)綜述

豬囊尾蚴疫苗的研究進(jìn)展

李婷婷①劉 陽(yáng)①蘇永超①杜立銀①②*（①內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 內(nèi)蒙古通遼 028000 ②內(nèi)蒙古高校毒物與動(dòng)物疾病監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 內(nèi)蒙古 通遼）

豬囊尾蚴病是由豬帶絳蟲幼蟲寄生在人和豬等體內(nèi)而引發(fā)的一種人畜共患寄生蟲病，被世界公認(rèn)的經(jīng)濟(jì)病之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來極大經(jīng)濟(jì)損失，并且對(duì)人體健康存在嚴(yán)重的威脅，所以有效控制豬囊尾蚴病具有重要意義。雖然豬囊尾蚴病疫苗研究多種多樣，但是目前選擇特異性高且能有效快速防控豬囊尾蚴病的疫苗一直是個(gè)難題。本文就近年來豬囊尾蚴組織細(xì)胞苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗和其他新型疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

在我國(guó)北部豬囊尾蚴病發(fā)病率比較高，豬囊尾蚴大部分都寄生在豬的橫紋肌或活動(dòng)性較大的肌肉中，如隔肌、心肌和腦等。囊尾蚴的中間宿主和終末宿主都是人，并且只有人是囊尾蚴終末宿主。囊尾蚴病抗原多種多樣，如蟲體抗原、囊液抗原、分泌抗原等。目前免疫學(xué)診斷與治療非常困難，由此越來越多的學(xué)者通過基因工程技術(shù)改善此現(xiàn)象，使純化抗原方法更加簡(jiǎn)潔。通過制備新型疫苗，如基因工程疫苗和DNA疫苗，使更多的動(dòng)物獲得保護(hù)，因此研制豬囊尾蚴病新型疫苗對(duì)防治豬囊尾蚴病具有重大意義[1]。

1 豬囊尾蚴組織細(xì)胞苗

當(dāng)豬囊尾蚴蟲體抗原疫苗生產(chǎn)受到限制時(shí)，許多寄生蟲研究人員開始對(duì)豬囊尾蚴組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)研究。Jingru[2]對(duì)囊尾蚴展開體外細(xì)胞繁殖，進(jìn)行免疫學(xué)研究，經(jīng)過17年的研究，成功構(gòu)建了CC-97原代細(xì)胞。此細(xì)胞株可以穩(wěn)定的生長(zhǎng)，不僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，而且存在遺傳穩(wěn)定性。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用CC-97細(xì)胞制備的抗原疫苗不僅安全，而且產(chǎn)生的應(yīng)答反應(yīng)快，高效持久，開創(chuàng)了制備豬囊尾蚴新型疫苗方法。

2 基因工程疫苗

2.1 TSO疫苗 （1）隨著基因工程技術(shù)發(fā)展的日益成熟，在純化抗原方法中，基因重組技術(shù)更加簡(jiǎn)潔方便，對(duì)診斷囊尾蚴病具有重大意義。目前，制備保護(hù)性囊尾蚴病抗原疫苗，尋找保護(hù)性抗原基因和克隆是解決囊尾蚴病的關(guān)鍵所在。獲得重組抗原的方法：①分離抗原可以應(yīng)用SDS-PAGE，再用Western blotting分析鑒定抗原條帶，制作高保護(hù)性抗體；②從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選出所用抗原基因；③將抗原基因克隆到載體表達(dá)；④用重組蛋白通過制備疫苗在進(jìn)行相關(guān)效果試驗(yàn)。（2）Johnson等[3]首次利用DNA重組技術(shù)創(chuàng)建了羊帶絳蟲六鉤蚴cDNA文庫(kù)，開發(fā)了重組45W抗原疫苗。用SDS-PAGE分離羊帶絳蟲六鉤蚴抗原，Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)，成功獲得了羊帶絳蟲六鉤蚴抗原，用該蛋白條帶制成的疫苗免疫羊，使其獲得較高的保護(hù)性。羊帶絳蟲(Tovis)蟲卵攻擊感染羊使羊達(dá)到98%保護(hù)率。隨后囊尾蚴的cDNA基因表達(dá)文庫(kù)中選出相同抗原基因cG1，構(gòu)造出pcDNA3-cGl重組載體，用其對(duì)仔豬進(jìn)行免疫試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示仔豬獲得高特異性免疫保護(hù)，說明此疫苗可以刺激仔豬產(chǎn)生免疫應(yīng)答得到免疫保護(hù)，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)過免疫后的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)囊尾蚴細(xì)胞凋亡[3]。把囊尾蚴的磷蛋白P12的基因在畢赤酵母菌內(nèi)克隆表達(dá)，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，首先得到帶有目的基因的重組蛋白的菌株，經(jīng)過SDS-PAGE和Western-blot結(jié)果分析顯示，囊尾蚴患者的陽(yáng)性血清對(duì)該重組蛋白可進(jìn)行識(shí)別[4]。駱學(xué)農(nóng)等[5]通過TSO45W-4BX基因與TSO囊尾蚴階段的18ku基因進(jìn)行整合，制備出pGEX-4BX/18基因，整合大腸埃希菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，被感染的豬囊尾蚴初期陽(yáng)性血清可以識(shí)別被整合產(chǎn)物，此整合產(chǎn)物與206佐劑免疫家豬，發(fā)現(xiàn)免疫豬的絳蟲卵攻擊后3個(gè)月后減蟲率仍然高達(dá)97%，此后減蟲率依舊保持相當(dāng)高的水平。（3）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所對(duì)大腸桿菌和酵母中表達(dá)的TSO45W型基因產(chǎn)物進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中修飾過的45W-4B可以實(shí)現(xiàn)高效可溶性表達(dá)，對(duì)豬減蟲率高達(dá)95%以上，而且表達(dá)產(chǎn)物可以長(zhǎng)時(shí)間保存。豬帶絳蟲45W基因家族以及TSOL18基因成功被克隆出來后，并且在大腸桿菌、酵母內(nèi)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，若206佐劑與其表達(dá)產(chǎn)物一起制備的抗原疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫，使豬獲得高效保護(hù)其減蟲率可在90%以上[6-8]。

2.2 LLPG疫苗 小扁豆凝集素糖蛋白(lentil lectin purified glycoproteins，LLGP)的一個(gè)抗原為T24蛋白，通過RT-PCR擴(kuò)增T24基因，并且構(gòu)造T24基因的兩個(gè)不同的表達(dá)載體，pGEX-4T-1和pPIC9K。經(jīng)過SDS-PAGE檢測(cè)證明pGEX-T24重組蛋白約為40kDa，囊尾蚴陽(yáng)性血清可以成功識(shí)別此重組蛋白；用其給小鼠接種免疫，免疫1周后

對(duì)小鼠進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示體內(nèi)存在血清抗體。一個(gè)月后再次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗體水平升高，說明重組蛋白免疫原性較高。LLGP中有一個(gè)抗原成分為GP50蛋白。周天祥等[9]應(yīng)用PCR方法在囊尾蚴cDNA文庫(kù)克隆出GP50基因，導(dǎo)入到pGEM-T載體中，再將其亞克隆在pBK-CMV載體中，構(gòu)造了pBK-CMV-GP50重組載體，通過IPTG進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過SDS-PAGE出現(xiàn)一條蛋白帶，大小約為36kDa，Western-blot表明豬囊尾蚴患者的血清可與此蛋白帶發(fā)生反應(yīng)，成功構(gòu)建了重組產(chǎn)物pBK-CMV-GP50抗原。

3 核酸疫苗

（1）核酸疫苗也稱基因疫苗，即DNA疫苗。通過接種編碼特定蛋白產(chǎn)物的核酸，刺激宿主對(duì)該抗原蛋白產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的，大量實(shí)驗(yàn)證明核酸也可以成為疫苗。核酸疫苗與普通疫苗相比更加快速、方便、特異性高、無危害性等，目前預(yù)防寄生蟲病也開始應(yīng)用核酸疫苗。（2）吳丹等[10]把整個(gè)cC1 cDNA序列導(dǎo)入pcDNA3的表達(dá)載體中，成功構(gòu)造出p3-cC1重組蛋白，將重組蛋白給小鼠肌肉接種，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫接種的小鼠血清里IgG和IgG2a抗體水平顯著增高。用同樣方法對(duì)5～10d齡仔豬進(jìn)行接種免疫，將免疫過的豬口服豬帶絳蟲卵，經(jīng)過90d后解剖檢查，發(fā)現(xiàn)免疫的仔豬得到有效保護(hù)，保護(hù)率可達(dá)73%，試驗(yàn)結(jié)果顯示豬囊尾蚴p3-cC1重組疫苗刺激仔豬機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)提高免疫水平[11]。王慶敏等[12]把pcDNA3-AgB與pcDNA3-IL-2的重組質(zhì)粒聯(lián)合表達(dá)，給小鼠進(jìn)行免疫接種，試驗(yàn)結(jié)果顯示免疫過的小鼠血清內(nèi)IgG與IgG2a抗體含量增加，脾細(xì)胞分泌IL-2濃度增加。經(jīng)過免疫保護(hù)后的豬用蟲卵攻擊，保護(hù)率高達(dá)83.4%，然而單一pcDNA3-AgB的重組質(zhì)粒保護(hù)率僅為70%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了IL-2表達(dá)載體可作為免疫增強(qiáng)佐劑，可以提高AgB核酸疫苗刺激機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)疫苗對(duì)機(jī)體的保護(hù)效果。

4 多肽疫苗

郭愛疆等[13]用RT-PCR方法將囊尾蚴蟲體基因克隆表達(dá)，把smallHSP和pGEX-4T-1(BL21)進(jìn)行融合，經(jīng)過SDSPAGE法顯示，smallHSP重組基因成功地在大腸桿菌里以GST重組蛋白方式出現(xiàn)，重組蛋白大小約為64 kDa。經(jīng)過Western blot分析證明豬囊尾蚴血清可以識(shí)別此重組蛋白，增加了診斷豬囊尾蚴病方法。吳國(guó)華等[14]把TSO的TSO10基因與囊尾蚴CE10基因插入載體內(nèi)表達(dá)，成功構(gòu)造pGEX-4T-TSO10與pGEX-4TCE10重組基因，重組基因?qū)氲酱竽c桿菌中融合表達(dá)。經(jīng)過SDSPAGE顯示，出現(xiàn)大小為35kDa重組蛋白。通過Western-blot檢測(cè)顯示囊尾蚴病患者的陽(yáng)性血清可以識(shí)別此重組蛋白，具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。用薄層掃描證明，無論是六鉤蚴還是囊尾蚴的10ku重組蛋白都可以在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行翻譯，重組蛋白10ku經(jīng)過ELISA的分析后，結(jié)果表明此重組蛋白能診斷囊尾蚴病。

5 其他新型疫苗的研究

目前噬菌體的隨機(jī)肽庫(kù)科研技術(shù)是新發(fā)展起來的，作為一種工具用來研究新疫苗。不僅可以準(zhǔn)確測(cè)定抗原表位，還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，即使沒有佐劑加入也可以使機(jī)體獲得高保護(hù)性。自此技術(shù)成功建立起來后，各個(gè)研究領(lǐng)域都開始應(yīng)用，逐漸向新型疫苗發(fā)展。經(jīng)過試驗(yàn)證明[15]通過噬菌體改良的疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫接種，發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)出現(xiàn)體液免疫和細(xì)胞免疫。把重組噬菌體作為新型疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的保護(hù)性，并且生產(chǎn)成本比較低，可以成為理想新型疫苗進(jìn)行田間試驗(yàn)。噬菌體重組疫苗不但能具有普通疫苗沒有的優(yōu)點(diǎn)，還汲取了死疫苗與活疫苗優(yōu)點(diǎn)，在疾病預(yù)防上存在顯著的長(zhǎng)處。噬菌體重組疫苗無論是對(duì)致病性微生物還是非致病性微生物均可應(yīng)用，都可使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

6 小結(jié)與展望

囊尾蚴抗原成分十分復(fù)雜，抗原重組影響疫苗的制備，但重組疫苗已在豬囊尾蚴病開始被廣泛應(yīng)用。重組抗原疫苗不僅具有較高的免疫原性，而且若與佐劑配伍免疫效果更明顯。重組疫苗存在的高特異性和大量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，避免缺少蟲體疫苗的問題，越來越多的學(xué)者開始更加注重。通過基因工程技術(shù)產(chǎn)生的重組抗原疫苗和核酸疫苗是寄生蟲領(lǐng)域研究的主要方向。在疾病預(yù)防和治療效果上新型疫苗存在效價(jià)高、耐持久、簡(jiǎn)潔方便等特點(diǎn)，具有更深遠(yuǎn)的開發(fā)和使用前景。

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S858.28

A

1007-1733(2015)09-0076-03

2015–07–27）

內(nèi)蒙古民族大學(xué)市校合作項(xiàng)目(SXYB2012088)；內(nèi)蒙古民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(NMDSS1426)

*通訊作者