郝 心（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東 泰安 271018）陳正濤王方昆王淑靜*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

調(diào)查報(bào)告

泰安地區(qū)冷鮮豬肉中沙門氏菌污染情況調(diào)查

郝 心①（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東 泰安 271018）陳正濤②王方昆②王淑靜②*（②山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

近年來食品安全問題倍受關(guān)注，其中因微生物污染造成的食源性疾病是是世界食品安全中較為突出的問題。沙門氏菌是腸桿菌科中一大類重要的人畜共患致病菌，是引起食源性細(xì)菌感染的最重要病原。病因主要是攝入污染沙門氏菌而未煮熟的食品或飲料等，而帶菌的畜禽肉胴體，奶制品以及其它畜禽產(chǎn)品是污染的重要來源。農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及超市成為城鄉(xiāng)居民獲得生鮮豬肉的主要來源，其豬肉衛(wèi)生質(zhì)量同每位消費(fèi)者的健康息息相關(guān)。本研究針對(duì)泰安市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)以及大型超市中的冷鮮肉沙門氏菌污染情況進(jìn)行了檢測(cè)，其中針對(duì)3個(gè)大型超市和4個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的28家生鮮豬肉銷售點(diǎn)218份樣品進(jìn)行采集分析，結(jié)果表明，泰安市生鮮豬肉中存在不同程度的污染，沙門氏菌的總檢出率為13.3%。其中，超市中檢出率為9.21%，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中檢出率為15.94%。

沙門氏菌病是一種重要的人畜共患病。1885年Salmon首次從患豬霍亂的病料中分離到豬霍亂桿菌。沙門氏菌廣泛分布于自然界，是腸桿菌科中一類重要的人畜共患、革蘭氏陰性病原菌。沙門氏菌在細(xì)菌性食物中毒中為發(fā)病率最高的一種。2003年曾曉芳調(diào)查結(jié)果顯示，我國細(xì)菌性中毒中有70%～80%是由沙門氏菌引起的[1]。沙門氏菌在自然界具有廣泛的宿主，少數(shù)如馬流產(chǎn)、羊流產(chǎn)、牛流產(chǎn)沙門氏菌，豬傷寒沙門氏菌等對(duì)宿主有選擇性外，大部分血清型的沙門氏菌屬于非適應(yīng)性或泛嗜性沙門氏菌，具有廣泛的宿主譜，能夠引起各種動(dòng)物包括人在內(nèi)的沙門氏菌病[2]。沙門氏菌作為病原菌對(duì)人畜健康和食品安全造成巨大的危害，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失，同時(shí)給人類帶來很多安全隱患以及健康方面的問題。沙門氏菌作為食品檢測(cè)中的一個(gè)重要指標(biāo)在畜牧獸醫(yī)、公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生等都具有非常重要的意義。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，催生出了快速、簡便、準(zhǔn)確、成本低的沙門氏菌檢測(cè)方法，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)的檢測(cè)手段發(fā)展為以DNA為基礎(chǔ)或以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，并在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷創(chuàng)新。常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法比較準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，至少3d才能得到初步結(jié)果[3,4]。1977年Kryinski和Heimsch首次將ELISA方法應(yīng)用在食品沙門氏菌的檢測(cè)，目前該法已經(jīng)廣泛用于沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等有害生物的檢測(cè)。此法缺點(diǎn)易造成結(jié)果假陽性或假陰性；優(yōu)點(diǎn)是該法檢測(cè)限較高，可以達(dá)到106cfu/ml[5]。其中還包括 噬菌體法[6,7]。我國科學(xué)家何曉青等人發(fā)現(xiàn)了一種作為腸桿菌科分屬診斷噬菌體，隨后科學(xué)家對(duì)該法進(jìn)行了大量研究[8-10]。此外，還可以對(duì)噬菌體進(jìn)行熒光標(biāo)記來檢測(cè)沙門氏菌。Kazuhiko等[11]用熒光標(biāo)記的T4噬菌體來檢測(cè)污水中大腸桿菌的含量。Ramji S. Lakshmanan等[12]利用噬菌體固定化磁致彈性傳感器技術(shù)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是美國科學(xué)家Mullis于1985年發(fā)明的一種體外擴(kuò)增特定基因或DNA的方法；基于其具有快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)，PCR技術(shù)廣泛用于食品中有害微生物的檢測(cè)[13]。目前用于沙門氏菌檢測(cè)的引物主要分為三大類[14]：屬特異基因引物、血清群特異基因引物和血清型特異基因引物。

本研究擬應(yīng)用PCR技術(shù)，擴(kuò)增FimY基因的屬特異基因引物設(shè)計(jì)引物，對(duì)泰安市大中型超市以及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中冷鮮豬肉中的沙門氏菌的污染情況進(jìn)行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠傷寒沙門氏菌陽性菌株：由本實(shí)驗(yàn)室保存。Taqplus DNA酶，dNTP，DEPC水購自北京全式金生物科技有限公司。凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀購自美國Bio-Rad公司；電泳儀購自北京六一儀器公司；高壓滅菌鍋購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 自泰安市各超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集新鮮豬肉若干份，保存于冰盒中于當(dāng)日送回實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

1.2.2 樣品處理 按照GB4789.4-2010的方法進(jìn)行直接增菌，稱取25g樣品放入盛有225ml BPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000～10000r/min均質(zhì)1～2min。用1mol/ml無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2，無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500ml無菌錐形瓶中，于37℃培養(yǎng)12h。

1.2.3 DNA的提取 取1.5ml上述培養(yǎng)混合菌液，12000rpm離心2min后用530μl TE重懸，加入30μl的10% SDS和60μl的1mg/ml蛋白酶K，混勻后37℃水浴1h；取出

再加入100μl的5mol/L NaCl溶液和80μl的CTAB/NaCl，65℃水浴10min，取出降至室溫后加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇體積比為25:24:1混合液，混勻12000rpm離心10min；吸取上清加入等體積的氯仿∶異戊醇體積比為24:1混合液，混勻12000rpm離心10min；取上清加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃靜置20min，12000rpm離心10min，用70%乙醇洗滌2次，室溫干燥后加入20μl pH8.0的TE溶解備用。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]設(shè)計(jì)FimY基因的PCR擴(kuò)增引物，以提取上述菌落全基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 Fimy基因PCR擴(kuò)增引物

PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1μl、10×buffer(不含Mg2+)5μl，25mmol/l MgCl23μl，dNTP (0.2mmol/L of each) 3μl，上下游引物各1μl，Taq DNA Polymerase 0.5μl，用滅菌去離子水補(bǔ)足至50μl，混勻離心10s。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像儀觀測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本的采集

分別從泰安市內(nèi)3個(gè)超市和4個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)進(jìn)行樣本采集。分別從三個(gè)超市中隨機(jī)抽取三家生鮮豬肉銷售點(diǎn)，每個(gè)銷售點(diǎn)隨機(jī)采取8～9分樣品；分別從4個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽取四家生鮮豬肉銷售點(diǎn)，隨機(jī)采樣與超市中采樣相同。

2.2 PCR檢測(cè)

將增菌后的菌液按堿裂解法抽提DNA，以抽提的DNA為模板，分別以Fimy1和Fimy2為引物急性PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1、2。

圖1 超市豬肉沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果M：DNA Marker；1-8/9：沙門氏菌PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果M：DNA Marker； M：DNA Marker； 1-8/9：沙門氏菌PCR檢測(cè)結(jié)果；10：陰性對(duì)照

2.3 樣本檢出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

見表2。

表2 檢出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

現(xiàn)階段，沙門氏菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)法、PCR法和免疫有關(guān)的檢測(cè)手段。傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在著費(fèi)時(shí)、操作繁瑣等諸多缺點(diǎn)，很難應(yīng)對(duì)大規(guī)模沙門氏菌的快速檢測(cè)；免疫學(xué)方法雖然可以得到相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果，但其成本高、靈敏度較低；相比較而言，PCR法具有靈敏、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，適合大樣本的調(diào)查。本研究采用傳統(tǒng)法分離與PCR法鑒定相結(jié)合的方式，實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確的從大批量樣本中對(duì)沙門氏菌的分離并鑒定的目的。調(diào)查結(jié)果顯示，泰安市豬肉中沙門氏菌的檢出率比較高，總的沙門氏菌的檢出率為13.3%；其中來自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的豬肉樣品沙門氏菌的檢出率和超市的豬肉樣品沙門氏菌檢出率分別為15.49%和9.21%，相比之下超市豬肉中沙門氏菌的污染要輕與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，這可能是由于運(yùn)輸途徑，搬運(yùn)、裝載過程中處理方式以及儲(chǔ)存環(huán)境不同造成的；無論是超市還是農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，淺層肉中沙門氏菌的檢出率要明顯高于深層肌肉，如本研究超市中淺層比深層高12.22個(gè)百分點(diǎn)，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中淺層比深層高5.45個(gè)百分點(diǎn)。這說明大部分的污染都是外源的，其中屠宰、加工、運(yùn)輸以及儲(chǔ)藏等過程中存在很大的風(fēng)險(xiǎn)。

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S852.61+2

A

1007-1733(2015)09-0060-03

2015–08–10）

泰安市大學(xué)生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目資助(2014DD004)

*通訊作者