洪昌明，鄭強(qiáng)蓀，劉雄濤，王洪濤，王彬，姜文瑞(中國人民解放軍總醫(yī)院，北京00853;第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院)

抗M2受體自身抗體對(duì)家兔心房電生理特性的影響

洪昌明1，鄭強(qiáng)蓀2，劉雄濤2，王洪濤2，王彬2，姜文瑞2
(1中國人民解放軍總醫(yī)院，北京100853;2第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院)

摘要:目的探討抗M2受體自身抗體對(duì)家兔心房電生理特性的影響。方法通過靜脈注射合成多肽制備抗

M2受體自身抗體陽性家兔模型，在離體灌注下檢測(cè)心房有效不應(yīng)期、房?jī)?nèi)傳導(dǎo)時(shí)間、竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間和心房重復(fù)反應(yīng)，并進(jìn)行心房顫動(dòng)(房顫)的誘發(fā)。結(jié)果抗M2受體自身抗體陽性家兔心房有效不應(yīng)期縮短，有效不應(yīng)期頻率適應(yīng)性降低，房?jī)?nèi)傳導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，心房重復(fù)反應(yīng)增多，竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，房顫誘發(fā)率增高。結(jié)論抗M2受體自身抗體能改變家兔心房電生理特性，有利于房顫的發(fā)生。

關(guān)鍵詞:m2受體;自身抗體;心房顫動(dòng);離體灌流

抗M2受體自身抗體是近年在擴(kuò)張型心肌病、高血壓、Chagas心肌病、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等患者中發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體［1～4］。研究［5］顯示，抗M2受體自身抗體陽性的擴(kuò)張型心肌病患者心房顫動(dòng)(房顫)發(fā)病率明顯增高，在部分被認(rèn)為是孤立性房顫患者中亦可檢出抗M2受體自身抗體?？筂2受體自身抗體的存在可能改變了心房肌的電生理特性，從而促進(jìn)房顫的發(fā)生。但抗M2受體自身抗體對(duì)心房電生理特性有何影響目前尚不清楚。本試驗(yàn)

擬通過建立抗M2受體自身抗體陽性家兔模型，觀察抗M2受體自身抗體對(duì)心房電生理特性的影響。

1　材料與方法

1.1材料新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，正常喂養(yǎng)。主要儀器與試劑:離體心臟灌流裝置(美國Radnoti公司)、64導(dǎo)多導(dǎo)電生理記錄儀(中國華南醫(yī)電公司)、4極記錄電極(美國EP公司)、戊巴比妥和弗氏佐劑均購自美國Sigma公司。

1.2造模及分組按照人M2受體細(xì)胞外第二環(huán)

功能表位肽段(169～193位)氨基酸序列，由西安藍(lán)晶公司合成多肽，25個(gè)氨基酸的序列為: V-R-T-VE-D-G-E-C-Y-I-Q-F-F-S-N-A-A-V-T-F-G-T-A-I。將多肽與載體蛋白——匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)連接，使其成為同時(shí)具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的大相對(duì)分子質(zhì)量完全抗原。將連接好的半抗原-載體蛋白混合物與等體積佐劑(第1次免疫使用完全弗氏佐劑，第2次及以后使用不完全弗氏佐劑)充分混合，使其完全乳化。采用常規(guī)微量多次免疫法免疫家兔，背部皮下多點(diǎn)注射。2周后進(jìn)行第2次免疫，以后每4周免疫1次，共7次。每次免疫后1周，采耳緣靜脈血檢測(cè)抗體效價(jià)。間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，多肽-KLH免疫后4周，動(dòng)物可檢出抗體陽性，此后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)抗體，純化抗體的最高效價(jià)可達(dá)1∶16 000，造模成功。將30只白兔分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各15只，實(shí)驗(yàn)組(M2組)為通過注射免疫6個(gè)月以后的動(dòng)物，均經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)抗M2受體自身抗體。對(duì)照組為正常新西蘭大白兔，與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)開始飼養(yǎng)。

1.3離體心臟灌流預(yù)熱離體灌流系統(tǒng)至37℃，用95% O2+ 5% CO2混合氣體對(duì)臺(tái)氏液進(jìn)行氧飽和。兔稱重后，通過耳緣靜脈注射3%戊巴比妥溶液麻醉(30mg/kg)，腹腔注射肝素1 000 U/kg。正中開胸，快速離斷各主要血管，迅速將心臟連同一段主動(dòng)脈(保留至少1 cm)取出，在冰臺(tái)式液中停跳。迅速剪開心包膜并剪去心臟周圍的氣管、肺組織等，在主動(dòng)脈根部穿一根線備用。將主動(dòng)脈套進(jìn)心臟插管口內(nèi)，用絲線將主動(dòng)脈和心臟插管結(jié)扎在一起并固定。待心臟復(fù)跳、穩(wěn)定后，將電極置于心房表面:左、右心耳各置一塊片狀電極，無關(guān)電極置于主動(dòng)脈根部。連接多導(dǎo)電生理儀、刺激儀。

1.4測(cè)量指標(biāo)①心房有效不應(yīng)期(AERP)和AERP頻率適應(yīng)性:測(cè)量AERP時(shí)將片狀記錄電極固定于心耳，刺激針位于同側(cè)心耳另一端。AERP:采用心臟程序期前刺激法測(cè)量AERP，分別以S1S1 =300ms、S1S1 = 250ms的基礎(chǔ)周長(zhǎng)進(jìn)行S1S2掃描，S1∶S2 =8∶1，S1S2以10ms遞減，到不應(yīng)期后延長(zhǎng)10ms，5ms遞減，不能奪獲心房的最長(zhǎng)S1S2間期為AERP，測(cè)量3次取均值。以(AERP300-AERP250)/ 50ms作為AERP頻率適應(yīng)性的判斷指標(biāo)。②房?jī)?nèi)傳導(dǎo)時(shí)間:將刺激電極置于右心耳近上腔靜脈處(靠近竇房結(jié))，記錄電極置于左心耳。右心耳刺激電極發(fā)放300ms的刺激信號(hào)，測(cè)量刺激信號(hào)傳到左心耳電極所需要的時(shí)間。③心房重復(fù)反應(yīng)(RAR):刺激電極置于右心耳，記錄電極置于左心耳，S1S1 =300ms，進(jìn)行S1S2掃描，S1∶S2 = 8∶1，S1S2以10ms遞減，直至不應(yīng)期。觀察記錄S2后的心房電位，以每一個(gè)向上的心房電位作為1個(gè)RAR，計(jì)總數(shù)。將每只兔在實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)出的最大RAR數(shù)作為該兔的RAR值。④竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間(SNRT)及校正的竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)間(CSNRT):以SNRT和CSNRT作為評(píng)定竇房結(jié)功能的指標(biāo)。將起搏電極和4極記錄電極置于右心耳。用較自身頻率快20 ppm的頻率起搏心房，每次刺激30 s后，停60 s;再按每次遞增20 ppm的頻率進(jìn)行下一次刺激，一直持續(xù)到SNRT不再延長(zhǎng)或起搏頻率已增至200 ppm。SNRT:從每一次刺激的最后一個(gè)脈沖信號(hào)開始，至恢復(fù)的第一個(gè)竇性p波開始之間的時(shí)距即為SNRT。CSNRT: CSNRT = SNRT－PP間期。⑤房顫誘發(fā)率:采用分級(jí)遞增的Burst刺激方法。初始刺激為波長(zhǎng)100ms的Burst刺激，持續(xù)時(shí)間2 s，依次減低波長(zhǎng)5ms，直至減至60ms;誘發(fā)出的房顫定義為持續(xù)時(shí)間大于2 s的快速不規(guī)則心房電活動(dòng)。若一次刺激不能誘發(fā)出定義中的房顫，則再重復(fù)刺激一次。若兩次刺激中誘發(fā)出一次持續(xù)大于2 s的房顫，則該動(dòng)物為可誘發(fā)房顫動(dòng)物;若兩次刺激完成后仍未誘發(fā)出持續(xù)大于2 s的房顫，則該動(dòng)物為不可誘發(fā)房顫動(dòng)物，不再進(jìn)行刺激。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1抗M2受體自身抗體對(duì)AERP和AERP頻率適應(yīng)性的影響S1S1 = 300ms時(shí)，M2組與對(duì)照組AERP分別為(62.1±8.3)、(83.9±7.5)ms AERP頻率適應(yīng)性分別為0.09±0.05、0.17±0.07，兩組比較，P均＜0.05。

2.2抗M2受體自身抗體對(duì)房?jī)?nèi)傳導(dǎo)時(shí)間的影響

M2組與對(duì)照組的房?jī)?nèi)傳導(dǎo)時(shí)間分別為(23.9± 2.6)、(17.4±2.3)ms，兩組比較，P＜0.05。

2.3抗M2受體自身抗體對(duì)RAR的影響M2組在早搏刺激后出現(xiàn)了一連串快速、不規(guī)則、碎裂的心房電活動(dòng)，類似于一次很短暫的房顫發(fā)作。M2組與對(duì)照組RAR數(shù)分別為(18.5±9.4)、(2.1±1.1)次，兩組比較，P＜0.01。

2.4抗M2受體自身抗體對(duì)SNRT和CSNRT的影響M2組、對(duì)照組的SNRT分別為(441.0± 48.8)、(384.8±31.8)ms，CSNRT分別為(134.9± 23.3)、(98.4±17.6)ms，兩組比較，P均＜0.05。

2.5抗M2受體自身抗體對(duì)房顫誘發(fā)的影響M2

組有11個(gè)離體心臟(11/15)誘發(fā)出持續(xù)時(shí)間大于2 s的房顫，而對(duì)照組僅有2個(gè)離體心臟(2/14，1個(gè)心臟未能完成實(shí)驗(yàn))誘發(fā)出持續(xù)時(shí)間大于2 s的房顫。兩組房顫誘發(fā)率比較，P＜0.05。

3　討論

Fu等［1］首次報(bào)道了在擴(kuò)張型心肌病患者血清中存有抗M2受體自身抗體。這種自身抗體可特異性地識(shí)別M2受體細(xì)胞外第二環(huán)上的169～193氨基酸序列的表位肽段，與以此肽段為抗原經(jīng)家兔免疫制成的多克隆抗體有相同的免疫和功能特性［6，7］。本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff離體心臟灌流裝置進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)，盡量減少自身自主神經(jīng)系統(tǒng)張力對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。Baba等［5］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，M2受體自身抗體的存在與擴(kuò)心病患者房顫的高發(fā)病率有關(guān)。在擴(kuò)心病患者中，抗M2受體自身抗體陽性者比陰性者心房顫動(dòng)更多見。除了年齡和血漿ANP水平外，抗M2受體自身抗體陽性是心房顫動(dòng)發(fā)生的最強(qiáng)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗M2受體自身抗體陽性動(dòng)物AERP顯著短于正常對(duì)照，有效不應(yīng)期頻率適應(yīng)性下降;房?jī)?nèi)傳導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)于正常對(duì)照;早搏刺激誘發(fā)出更多的心房重復(fù)反應(yīng); SNRT 和CSNRT均顯著延長(zhǎng); Burst刺激更易誘發(fā)出房顫。

M2受體自身抗體對(duì)心房造成的這些影響與其作為M2受體激動(dòng)劑的生物學(xué)作用有關(guān)［3，8］?？筂2受體自身抗體可產(chǎn)生激動(dòng)劑樣反應(yīng)［3］。阻斷異丙腎上腺素刺激引起的L型鈣離子流，并能隨滴度增加而縮短動(dòng)作電位時(shí)程［3，8］。APD的縮短導(dǎo)致了AERP的縮短，加上傳導(dǎo)速度的減慢，為多子波折返提供了條件［9］，而不應(yīng)期頻率適應(yīng)性的下降則有助于房早觸發(fā)房顫。近年來迷走神經(jīng)在心房顫動(dòng)發(fā)病機(jī)制中的作用日益得到重視［10，11］，抗M2受體自身抗體的M2受體激動(dòng)劑樣作用與迷走神經(jīng)激活作用一致。心房易損性指心房是否易于誘發(fā)心律失常。RAR是衡量心房易損性的一個(gè)指標(biāo)。心房的相對(duì)不應(yīng)期比心房的有效不應(yīng)期一般長(zhǎng)10～30ms，相對(duì)不應(yīng)期與有效不應(yīng)期間的這段時(shí)間又稱為心房易損期，給予期前刺激可誘發(fā)反復(fù)的心房激動(dòng)，記錄這些反復(fù)的心房激動(dòng)次數(shù)即為RAR。這種反復(fù)的心房激動(dòng)可能變成持續(xù)性，并可能導(dǎo)致房撲或房顫的發(fā)生。RAR越多，說明早搏越易引起心房的反復(fù)激動(dòng)，即心房易損性增加，易于發(fā)生房性心律失常。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在早搏刺激后出現(xiàn)了一連串快速、不規(guī)則、碎裂的心房電活動(dòng)，類似于一次很短暫的房顫發(fā)作。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抗M2受體自身抗體陽性動(dòng)物RAR比正常對(duì)照顯著增加，說明抗M2受體自身抗體陽性動(dòng)物的心房易損性增加，早博刺激更易引起心房的反復(fù)激動(dòng)，增加了發(fā)生房顫的可能性。而使用Burst刺激誘發(fā)房顫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步直接證實(shí)了M2受體自身抗體陽性的動(dòng)物更易誘發(fā)房顫。

本研究結(jié)果提供了抗M2受體自身抗體影響心房電生理特性的直接證據(jù)?？筂2受體自身抗體陽性動(dòng)物的AERP縮短、AERP頻率適應(yīng)性下降、房?jī)?nèi)傳導(dǎo)時(shí)間減慢，為房顫的發(fā)生提供了基礎(chǔ); RAR的增多說明心房易損性增加; Burst刺激誘發(fā)房顫實(shí)驗(yàn)則直接證明抗M2受體自身抗體陽性動(dòng)物更易于發(fā)生房顫。

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·臨床研究·

收稿日期:( 2015-04-13)

文章編號(hào):1002-266X(2015)33-0032-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R541

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.011