戚勛，苑永輝，鐘紅珊，徐克(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧省影像診斷與介入治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)000;遼寧省腫瘤醫(yī)院)

2-羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響

戚勛1，苑永輝2，鐘紅珊1，徐克1
(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧省影像診斷與介入治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001;2遼寧省腫瘤醫(yī)院)

摘要:目的探討2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外增殖和遷移的作用。方法體外培養(yǎng)HUVEC，分為兩組，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10(－10)、10(－9)、10(－8)、10(－7)、10(－6)、10(－5)mol/L的2HP-β-CD，空白組加入含0.5% FBS的等量培養(yǎng)液。采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力，改良Boyden Chamber法檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組中，加入10(－10)、10(－9)、10(－8)mol/L 2HP-β-CD者的OD(450)分別為空白組的1.4、1.6、1.7倍，10(－8)mol/L 2HP-β-CD增強(qiáng)細(xì)胞增殖活力的作用最明顯(P均＜0.01) ;加入10(－7)、10(－6)、10(－5)mol/L 2HP-β-CD者的OD(450)與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入10(－9)及10(－8)mol/L 2HP-β-CD者細(xì)胞遷移數(shù)顯著高于空白組(P均＜0.05)，其他濃度組細(xì)胞遷移數(shù)與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論適當(dāng)濃度的2HP-β-CD可促進(jìn)HUVEC的增殖和遷移。

關(guān)鍵詞:2-羥丙基-β-環(huán)糊精;臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞遷移;細(xì)胞增殖;血管新生

治療性血管新生是指將外源性血管新生誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)入組織中，促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)支毛細(xì)血管新生［1］，是近年來(lái)治療局部缺血性疾病的重要方法［2］。血管新生過(guò)程與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖密切相關(guān)［3］。環(huán)糊精(CD)是一類環(huán)狀低聚糖，研究顯示，β-CD可以刺激兔角膜血管新生［4］，而高濃度硫酸-β-環(huán)糊精具有抑制血管新生的作用［5］。關(guān)于2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)對(duì)血管新生作用的報(bào)道少見(jiàn)。2014年6～12月，我們觀察了2HP-β-CD對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖和遷移的作用，旨在為治療性血管新生提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料HUVEC購(gòu)于南京凱基生物，解凍復(fù)蘇后加入含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞融合至80%～90%狀態(tài)后用于實(shí)驗(yàn)。2HP-β-CD、牛血清白蛋白、纖粘連蛋白、PBS及RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本Dojindo公司，青、鏈霉素和胰蛋白酶購(gòu)于南京凱基生物，Diff-Quick染液購(gòu)于北京Propbs公司，Boyden Chamber 及8 μm PVPF聚碳酸膜購(gòu)于Neuroprobe。

1.2細(xì)胞增殖活力檢測(cè)采用CCK-8法。取HUVEC細(xì)胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液。按每孔1 500個(gè)接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，加入含0.5% FBS的培養(yǎng)液預(yù)處理24 h，以達(dá)到細(xì)胞同步化。細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和空白組，實(shí)驗(yàn)組又分為6個(gè)濃度亞組，分別為N－10、N－9、N－8、N－7、N－6、N－5組，分別加入濃度為10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol/L的2HP-β-CD，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，按100 μL/孔加入含藥培養(yǎng)液，空白組加入含0.5% FBS的等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的OD值。

1.3細(xì)胞遷移能力檢測(cè)采用改良Boyden Chamber法。將8 μm PVPF聚碳酸膜經(jīng)10 μg/mL纖粘連蛋白浸泡4℃過(guò)夜，使用前1 h晾干。按1.2的方法進(jìn)行細(xì)胞分組。分別于下室每孔加入濃度為10－10、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol/L 2HP-β-CD 36 μL及含0.5% FBS的等量培養(yǎng)液，另取含0.5% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基、血清饑餓24 h的HUVEC細(xì)胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成含0.25% BSA 的RPMI1640細(xì)胞懸液，分別于上室每孔加入含細(xì)胞2.5×105/mL的細(xì)胞懸液200 μL。上、下室之間隔以8 μm PVPF聚碳酸膜，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育5 h。取出濾膜，Diff-Quick染液試劑盒固定、染色，取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用PRISM6.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以珋x±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多樣本間比較采用單向方差分析Dunnet-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

N－10、N－9、N－8組細(xì)胞增殖活力較空白組顯著增強(qiáng)(P均＜0.01) ; N－10、N－9、N－8組細(xì)胞增殖活力與2HP-β-CD濃度呈劑量依賴性(P＜0.05)。N－7、N－6、N－5組細(xì)胞增殖活力與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。與空白組比較，N－9、N－8組內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加(P均＜0.05)，其余濃度組與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。

表1　各組細(xì)胞增殖活力與遷移能力比較(n=6，±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別　細(xì)胞增殖活力(OD450)　細(xì)胞遷移數(shù)(個(gè))實(shí)驗(yàn)組N－10　2.82±0.17＊＊　40.67±2.91 N－9　3.18±0.15＊＊　112.17±29.27*N－8　3.34±0.13＊＊　116.67±21.92*N－7　2.39±0.19　78.67±18.26 N－6　2.57±0.24　86.33±8.17 N－5　2.17±0.07　40.41±4.66空白組2.04±0.20　49.60±4.55

3　討論

完整的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)是血管壁發(fā)揮正常功能的必要條件，血管損傷可導(dǎo)致內(nèi)皮功能喪失或失去完整性，引起動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄，因此促進(jìn)和恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞完整性具有重要意義。血管新生是一個(gè)新的微血管發(fā)展成一個(gè)血流供應(yīng)系統(tǒng)的過(guò)程。在血管新生過(guò)程中，首要步驟是內(nèi)皮細(xì)胞在趨化因子的作用下發(fā)生遷移、增殖［6］。要達(dá)到治療性血管新生的目的，血管新生誘導(dǎo)因子必須作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體，引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，形成毛細(xì)血管樣管腔結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)過(guò)血管的重構(gòu)形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)［7，8］。

CD是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，具有親水的外圍和疏水的核心，其核心具有分子識(shí)別作用，可以選擇性包絡(luò)特定物質(zhì)。CD通常含有6～12個(gè)D-吡喃葡萄糖單元，其中研究較多的是含有6、7、8個(gè)葡萄糖單元的分子，分別稱為α-CD、β-CD和γ-CD［9］。研究表明，與CD同屬于多糖的葡萄糖胺聚糖可以通過(guò)激活血管新生相關(guān)的生長(zhǎng)因子受體來(lái)調(diào)節(jié)血管新生生長(zhǎng)因子的活性，從而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有一定的作用。Folkman等［4］報(bào)道，β-CD可以刺激兔角膜血管新生達(dá)正常組的303%，對(duì)照組則為正常組的164%。

本研究顯示，體外環(huán)境下，2HP-β-CD能夠明顯促進(jìn)HUVECs的增殖和遷移。Bachinsky等［10］報(bào)道，β-CD是一種肝素類似物，可產(chǎn)生高密度負(fù)電荷，通過(guò)與染料和肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子(即成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)等陽(yáng)離子型分子結(jié)合而產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)。本研究中，10－10、10－9、10－8mol/L的2HP-β-CD能夠劑量依賴性地增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力，10－9和10－8mol/L的2HP-β-CD可顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，可能是由于β-CD與肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合后形成復(fù)合物后，使肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子具有一定的緩釋作用，從而穩(wěn)定、持續(xù)地發(fā)揮生物學(xué)作用，目前已知肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉細(xì)胞和神經(jīng)外胚層在內(nèi)的一系列細(xì)胞增殖的作用，因此適當(dāng)濃度的2HP-β-CD可能是通過(guò)上述機(jī)制促進(jìn)HUVEC的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，高濃度的2HP-β-CD未能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，推測(cè)其原因可能與過(guò)高濃度的2HP-β-CD產(chǎn)生過(guò)多的高密度負(fù)電荷，與肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合形成復(fù)合物后，難以釋放出肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子，從而影響肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子與其受體的結(jié)合有關(guān)。

綜上所述，2HP-β-CD能夠明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，推測(cè)其在缺血性疾病血管新生的發(fā)生和發(fā)展中具有一定作用，有利于缺血部位側(cè)支循環(huán)的形成。其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步證實(shí)。

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Effect of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin on migration and proliferation of HUVECs

QI Xun1，YUAN Yong-hui，ZHONG Hong-shan，XU Ke
(1 The First Affiliated Hospital of China Medical University，Key Laboratory of Diagnostic Imaging and Interventional Radiology of Liaoning Province，Shenyang 110001，China)

Abstract:Objective To investigate the effect of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2HP-β-CD) on the migration and proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro.Methods HUVECs were cultured in vitro and were divided into two groups: the experimental group and the blank group.HUVECs in the experimental group were treated with different concentrations of 2HP-β-CD (10(－10)-10(－5)mol/L)，and the same amount of 0.5% FBS was added into the blank group.CCK-8 was used to detect the cell proliferation activities of the two groups，and the modified Boyden Chamber was applied to observe the cell migration in each group.Results The OD(450)of the experimental group which was added with 10(－10)mol/L，10(－9)mol/L and 10(－8)mol/L 2HP-β-CD was 1.4，1.6 and 1.7 times higher than that of the blank group; and 10(－10)mol/L 2HP-β-CD had the most significant effect in promoting the proliferation of HUVECs (all P＜0.01).No significant difference was found in OD(450)of the two groups when we added 10(－7)，10(－6)and 10(－5)mol/L 2HP-β-CD to HUVECs.The migration of HUVECs which were added with 2HP-β-CD at the concentration of 10(－9)mol/L and 10(－8)mol/L in the experimental group was significantly higher than that of the blank group (all P＜0.05).When we added other concentrations of 2HP-β-CD，no significant difference was found in the cell migration between the experimental and blank groups.ConclusionSuitable concentrations of 2HP-β-CD can promote the migration and proliferation of HUVECs.

Key words:2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin; umbilical vein endothelial cells; cell migration; cell proliferation; angiogenesis

(收稿日期:2015-01-30)

通信作者簡(jiǎn)介:徐克(1954-)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榻槿敕派鋵W(xué)。E-mail: kexu@ vip.sina.com

作者簡(jiǎn)介:第一戚勛(1980-)，女，講師，血管分子生理學(xué)博士，研究方向?yàn)槿毖Ｐ偷难苄律-mail: qixun716@ hotmail.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201168) ;遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2012282)。

文章編號(hào):1002-266X(2015) 18-0004-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R331.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.002