單莉,郝春妮(煙臺山醫(yī)院,山東煙臺264001)
宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化及意義
單莉,郝春妮
(煙臺山醫(yī)院,山東煙臺264001)
摘要:目的觀察宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的表達(dá)變化,并探討其意義。方法108例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者,手術(shù)切除腫瘤組織,免疫組化學(xué)染色觀察宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中、Foxp3+、GranzymeB+、細(xì)胞的分布,同時對其進(jìn)行計(jì)數(shù)。分析其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者Foxp3+細(xì)胞數(shù)量癌內(nèi)大于癌周、細(xì)胞數(shù)量癌周大于癌內(nèi)(P均<0.05)。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞數(shù)量與臨床分期有關(guān),F(xiàn)oxp3+細(xì)胞數(shù)量與病理分級有關(guān)和Foxp3+細(xì)胞數(shù)量與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Foxp3+細(xì)胞與患者無瘤生存時間呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.217,95%CI: 1.843~2.671,P=0.012),與總生存時間呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.451,95% CI: 1.992 ~2.734,P=0.033)。結(jié)論宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織內(nèi)、細(xì)胞數(shù)量增多,F(xiàn)oxp3+細(xì)胞數(shù)量減少。Foxp3+細(xì)胞是宮頸鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。
關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;宮頸鱗狀細(xì)胞癌;免疫微環(huán)境;免疫逃逸;腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞
宮頸鱗狀細(xì)胞癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命。關(guān)于宮頸鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后因素研究一直聚焦于腫瘤細(xì)胞本身,較少研究與腫瘤局部免疫微環(huán)境指標(biāo)的關(guān)系。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)以T細(xì)胞為主的一種異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群體,是機(jī)體淋巴細(xì)胞浸入到腫瘤組織內(nèi)部對腫瘤的抵抗現(xiàn)象,它們的抗腫瘤免疫效應(yīng)主要是細(xì)胞免疫反應(yīng)[1,2]。本研究主要的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的亞型有、Foxp3+細(xì)胞,暫未列入細(xì)胞[3,4]。本研究觀察了宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的表達(dá)變化,并探討其意義。
1.1臨床資料選取2010年1月~2014年12月在煙臺山醫(yī)院住院手術(shù)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者108例,年齡35~72(45.3±9.6)歲,均有完整的臨床病理資料。依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO,2000年)修訂的臨床分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期42例、Ⅱ期31例、Ⅲ期35 例;病理分級: G1級30例、G2級43例、G3級35例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例?;颊呔惺中g(shù)完整切除腫瘤,組織學(xué)檢查切緣陰性。排除標(biāo)準(zhǔn):曾接受過放化療及免疫治療;合并免疫系統(tǒng)疾病;合并慢性消耗性疾病及傳染病;合并有其他類型惡性腫瘤。
1.2腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞檢測及其與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系分析方法采用免疫組化法檢測108例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織中NK細(xì)胞、Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、GranzymeB+活化的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞、CD45RO+記憶T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞的數(shù)量。用不同的單克隆抗體[鼠抗人CD45RO、鼠抗人CD57、兔抗人CD8、鼠抗人GranzymeB購自Maixin-Bio(邁新生物),F(xiàn)oxp3+抗體購自BioLegend(USA)]對上述細(xì)胞行免疫組化染色。二抗為Leica-二抗套裝試劑。采用Leica公司的全自動免疫組化染色一體機(jī),所有步驟由Bond-Max自動完成。在400倍高倍顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞(細(xì)胞膜或細(xì)胞核呈棕色或棕黑色顆粒者判定為陽性細(xì)胞)。采用電腦圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)選取5個高倍視野拍照,再用圖像分析軟件(NIH Image 1.46 bundled with 64-bit Java)計(jì)算總陽性細(xì)胞數(shù)。由2位高年資病理科醫(yī)師讀片,采取雙盲交叉讀片,取平均值。患者臨床病理資料包括年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況等。生存期從手術(shù)當(dāng)天計(jì)算,終止日期為死亡日期或末次隨訪日,所有病例截止日期為2014年6月31日。對可疑復(fù)發(fā)者進(jìn)行強(qiáng)化CT和(或) MR掃描來確診復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移。分析上述免疫細(xì)胞與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示,多組間比較采用one-way ANOVA,兩組間比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn);相關(guān)分析采用Spearman相關(guān);累積生存時間和累積生存率計(jì)算采用Kaplan-Meier法,生存檢驗(yàn)采用Log-rank檢驗(yàn);用Cox回歸模型作單因素和多因素與預(yù)后關(guān)系的分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的分布、數(shù)量除Foxp3+陽性染色細(xì)胞為細(xì)胞核棕色著色外,其余細(xì)胞均呈細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜棕色染色。細(xì)胞呈圓形或橢圓形,散在分布于腫瘤細(xì)胞和周圍間質(zhì)中,沒有明顯的密集趨勢。GranzymeB+陽性染色呈顆粒狀的細(xì)胞質(zhì)著色,細(xì)胞無密集趨勢,均散在分布于癌組織、周圍增生的纖維組織中,棕色陽性顆粒可環(huán)繞細(xì)胞呈圓形或半圓形。CD45RO+陽性細(xì)胞呈細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜棕褐色,細(xì)胞體積較小,大部分彌散性分布。細(xì)胞為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色的小圓細(xì)胞。宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌內(nèi)、癌旁組織中細(xì)胞分別為30.15±細(xì)胞分別為340.53±50.11、430.29±38.74,GranzymeB+細(xì)胞分別為29.03±1.53、40.37±3.42細(xì)胞分別為128.71 ±22.73、240.38±37.97,F(xiàn)oxp3+細(xì)胞分別為31.03 ±2.41、19.32±3.56,兩者比較,P均<0.05。
2.2宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞數(shù)量與患者臨床分期有關(guān)(P均<0.05),腫瘤臨床分期越高細(xì)胞局部浸潤越少。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Foxp3+和細(xì)胞數(shù)量與患者病理分級有關(guān)(P均<0.05),腫瘤分化越差患者Foxp3+細(xì)胞越多,腫瘤分化越好患者細(xì)胞越多。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞數(shù)量與患者淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05),有淋巴轉(zhuǎn)移的患者Foxp3+細(xì)胞越多,無淋巴轉(zhuǎn)移的細(xì)胞越多。詳見表1。
表1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(個,±s)
臨床病理參數(shù) n CD+57 CD45RO+ GranzymeB+ CD+8 Foxp3+年齡≤40歲 35 29.65±2.56 346.78±98.54 28.43±6.21 126.65±23.97 30.23±4.56 >40歲 73 30.42±6.16 334.53±65.11 29.85±3.47 130.91±31.17 31.77±7.23臨床分期Ⅰ42 28.32±3.61 394.28±64.14 29.72±5.33 149.83±25.14 28.41±4.34 Ⅱ31 31.77±2.79 336.43±23.77 28.63±2.37 124.74±35.36 30.28±5.16 Ⅲ35 29.32±1.57 287.24±71.35 29.09±3.24 96.23±13.42 30.13±3.75病理分級G1 30 27.57±9.47 380.79±31.11 30.41±2.31 121.37±13.41 36.24±5.6 G2 43 29.91±3.04 326.88±26.12 29.04±4.27 128.43±13.54 30.27±1.02 G3 35 28.97±1.45 286.27±24.41 28.78±3.44 128.17±12.87 25.97±3.47淋巴轉(zhuǎn)移有41 31.22±3.82 328.59±79.31 27.13±1.25 106.43±18.64 39.27±3.86 無67 28.89±2.63 357.64±81.35 29.23±3.51 147.59±18.17 22.23±4.76
2.3宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞與患者預(yù)后的關(guān)系108例患者整體的5年無瘤生存率分別為53.70%,總生存率為47.22%。中位隨訪時間為28個月(3~80個月)。主要死于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。使用X-tile軟件計(jì)算出的最小P值作為cutoff值將各腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞分成高浸潤組、低浸潤組。CD5+7細(xì)胞cut-off值為29.36,高浸潤組45例、低浸潤組63例; CD45RO+細(xì)胞cut-off值為310.58,高浸潤組68例、低浸潤組40例; CD8+細(xì)胞cut-off值為115.71,高浸潤組60例、低浸潤組48例; GranzymeB+細(xì)胞cut-off值為28.47,高浸潤組57例、低浸潤組51例; Foxp3+細(xì)胞cut-off值為27.17,高浸潤組49例、低浸潤組59例。COX單因素生存分析顯示,患者無瘤生存時間(DFS)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD8+細(xì)胞(HR: 0.997,95% CI: 0.684~1.314,P=0.028)呈正相關(guān)、Foxp3+細(xì)胞(HR: 2.217,95%CI: 1.843~2.671,P=0.012)呈負(fù)相關(guān);患者總生存時間(OS)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD8+細(xì)胞(HR: 1.057,95%CI: 0.792~1.372,P=0.046)呈正相關(guān)、Foxp3+細(xì)胞(HR: 2.451,95% CI: 1.992~2.734,P=0.033)呈負(fù)相關(guān);患者DFS、OS與癌組織CD5+7、CD45RO+、GranzymeB+細(xì)胞無關(guān)。COX多因素生存分析顯示,宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Foxp3+細(xì)胞與患者DFS呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.217,95% CI: 1.843~2.671,P=0.012),與OS呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.451,95%CI: 1.992~2.734,P=0.033)。
作為腫瘤與機(jī)體作用的主要部位,腫瘤局部免疫反應(yīng)在一定程度上反映了機(jī)體抗腫瘤免疫的總體水平。腫瘤局部的免疫以特異性的細(xì)胞免疫為主導(dǎo),其效應(yīng)細(xì)胞為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。NK細(xì)胞具有無需抗原刺激即能殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞被一致認(rèn)為是最主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞[1,5]?;罨募?xì)胞毒性T細(xì)胞以GranzymeB+為標(biāo)志物??乖禺愋杂洃汿淋巴細(xì)胞可以在特定細(xì)胞因子的作用下分化為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞,也可以像干細(xì)胞一樣自我更新、繼續(xù)分化為記憶/效應(yīng)細(xì)胞,因此記憶T細(xì)胞可以作為T細(xì)胞活化標(biāo)志[3,4]。Foxp3+Treg具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能。以上細(xì)胞均在局部免疫微環(huán)境中發(fā)揮著免疫監(jiān)視、免疫效應(yīng)、殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[6,7]。
本研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌周圍的、細(xì)胞數(shù)量明顯多于癌內(nèi)部,這表明機(jī)體在腫瘤周圍的免疫反應(yīng)明顯強(qiáng)于腫瘤內(nèi)部。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),宮頸鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期越晚,細(xì)胞局部浸潤越少;腫瘤分化越差,CD45RO+細(xì)胞越少,這說明隨著病情進(jìn)展,腫瘤晚期內(nèi)部微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)越來越嚴(yán)重。同時,細(xì)胞在有淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中數(shù)量少于無淋巴轉(zhuǎn)移者,提示腫瘤是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移與局部免疫反應(yīng)有密切關(guān)系。
本研究還發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌內(nèi)的Foxp3+細(xì)胞浸潤數(shù)量較腫瘤周圍多。說明腫瘤內(nèi)微環(huán)境中,T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)受到了抑制。類似的差異也見于許多實(shí)體腫瘤,如胃癌、肺癌等。腫瘤局部Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量反映了在腫瘤內(nèi)部宿主與腫瘤之間的免疫活動。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)能抑制腫瘤細(xì)胞的潛在侵襲性,具有免疫抑制能力的Foxp3+Treg細(xì)胞則可能放任腫瘤侵襲[8,9]。這也進(jìn)一步可以解釋,在較差臨床分期的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中有高浸潤的Foxp3+Treg細(xì)胞??梢?,宮頸鱗狀細(xì)胞癌局部微環(huán)境中免疫抑制與免疫效應(yīng)作用的力量對比關(guān)系決定了局部的免疫狀態(tài),并影響甚至決定了腫瘤的進(jìn)展方向,局部免疫效應(yīng)作用越強(qiáng)越不利于腫瘤生長侵襲,局部免疫抑制作用越強(qiáng)越有利于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。
通過Cox單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn),宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量的多少是宮頸鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。有研究[10]曾報(bào)道Foxp3+Treg細(xì)胞高浸潤是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素??梢姡琓reg對免疫環(huán)境起負(fù)性作用,局部高浸潤Treg細(xì)胞可能直接導(dǎo)致宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者有較差的預(yù)后。其可能的機(jī)制主要是通過各種途徑直接或間接抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖,活化及抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用[11];引起DC細(xì)胞的凋亡[12];競爭抑制IL-2[8]等影響效應(yīng)T細(xì)胞對腫瘤的免疫應(yīng)答。
參考文獻(xiàn):
[1]Zubieta MR,F(xiàn)urman D,Barrio M,et al.Galectin-3 expression correlates with apoptosis of tumor-associated lymphocytes in human melanoma biopsies[J].Am J Pathol,2006,168(5) : 1666-1675.
[2]Lee HE,Chae SW,Lee YJ,et al.Prognostic implications of type and density of tumour-infiltrating lymphocytes in gastric cancer [J].Br J Cancer,2008,99(10) : 1704-1711.
[3]Zou W.Regulatory T cells,tumour immunity and immunotherapy [J].Nat Rev Immunol,2006,6(4) : 295-307.
[4]Wada Y,Nakashima O,Kutami R,et al.Clinicopathological study on hepatocellular carcinoma with lymphocytic infiltration[J].Hepatology,1998,27(2) : 407-414.
[5]Naito Y,Saito K,Shiiba K,et al. T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer [J].Cancer Res,1998,58(16) : 3491-3494.
[6]Ling KL,Pratap SE,Bates GJ,et al.Increased frequency of regulatory T cells in peripheral blood and tumour infiltrating lymphocytes in colorectal cancer patients[J].Cancer Immun,2007,(7) :7.
[7]Bates GJ,F(xiàn)ox SB,Han C,et al.Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse[J].J Clin Oncol,2006,24(34) : 5373-5380.
[8]Perrone G,Ruffini PA,Catalano V,et al.Intratumoural FOXP3-positive regulatory T cells are associated with adverse prognosis in radically resected gastric cancer[J].Eur J Cancer,2008,44 (13) : 1875-1882.
[9]張家麗,任秀寶.小細(xì)胞肺癌組織微環(huán)境中VEGF與DC成熟及Treg關(guān)系的探討[J].中國癌癥雜志,2012,22(7) : 25-28.
[10]Xia M,Zhao MQ,Wu K,et al.Investigations on the clinical significance of FOXP3 protein expression in cervical oesophageal cancer and the number of Foxp3+tumour-infiltrating lymphocytes [J].J Int Med Res,2013,41(4) : 1002-1008.
[11]Grossman WJ,Verbsky JW,Barchet W,et al.Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death[J].Immunity,2004,21(4) : 589-601.
[12]Ichihara F,Kono K,Takahashi A,et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers[J].Clin Cancer Res,2003,9(12) : 4404-4408.
(收稿日期:2015-01-21)
文章編號:1002-266X(2015) 19-0061-03
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B
中圖分類號:R737.33
doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.022