譚小方，金華，丁家怡

(南通市婦幼保健院，江蘇南通226006)

·綜述與講座·

體外胚胎培養(yǎng)液代謝組學(xué)分析在評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育潛能的研究進(jìn)展

譚小方，金華，丁家怡

(南通市婦幼保健院，江蘇南通226006)

代謝組學(xué)是對(duì)溶液、組織、細(xì)胞等生物樣本中的小分子代謝物進(jìn)行定性和定量分析，從而得到生物體受外界刺激后其代謝水平的整體變化的結(jié)果。其研究過(guò)程包括代謝組數(shù)據(jù)的采集、預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)記物識(shí)別和途徑分析等步驟。代謝組學(xué)作為一種新興技術(shù)，在輔助生殖技術(shù)中具有很好的應(yīng)用前景。胚胎的發(fā)育和代謝是個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，應(yīng)用質(zhì)譜分析、光譜分析和磁共振波譜技術(shù)能客觀、全面、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)地反映胚胎質(zhì)量及其發(fā)育潛能，可作為胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估的補(bǔ)充，從而提高胚胎種植率，提高單胚胎移植的妊娠率。

輔助生殖技術(shù)；胚胎培養(yǎng)液；代謝組學(xué)；胚胎發(fā)育潛能

應(yīng)用人類輔助生殖技術(shù)(ART)治療不孕不育時(shí)，胚胎質(zhì)量是影響胚胎種植的關(guān)鍵因素之一。臨床中常需要移植多枚胚胎來(lái)提高妊娠率，但會(huì)引起多胎妊娠率明顯提高，增加產(chǎn)科并發(fā)癥[1]。選擇性單胚胎移植可有效降低多胎率，但如何在降低多胎的同時(shí)不影響妊娠率，是目前面臨的挑戰(zhàn)[2]。目前主要根據(jù)卵裂球數(shù)量、發(fā)育速度、碎片、多核、空泡和卵裂球均一性等形態(tài)學(xué)評(píng)估胚胎質(zhì)量[3]。形態(tài)學(xué)評(píng)估具有直觀、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，便于迅速選擇胚胎，但仍缺乏足夠的準(zhǔn)確性并有一定的主觀性，不能真實(shí)反映胚胎的質(zhì)量及其發(fā)育潛能[4]。近年研究表明，體外胚胎養(yǎng)液代謝成分分析結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估可更有效地選擇有發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)胚胎?，F(xiàn)將近期研究結(jié)果綜述如下。

1 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介

代謝組學(xué)是研究生物整體、系統(tǒng)、器官或細(xì)胞的內(nèi)源性代謝物質(zhì)及內(nèi)在或外在因素相互作用的科學(xué)[5]。其研究目標(biāo)是對(duì)溶液、組織、細(xì)胞等生物樣本中相對(duì)分子質(zhì)量為1 000以下的小分子代謝物進(jìn)行定性和定量的分析，從而得到生物體受外界刺激后其代謝水平的整體變化的結(jié)果[6]。在基因—蛋白—代謝終產(chǎn)物這樣一個(gè)生物信息傳遞鏈中，機(jī)體需要通過(guò)不斷調(diào)整復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持自身與外界的互動(dòng)平衡。代謝物作為細(xì)胞調(diào)控的最終產(chǎn)物，能反映細(xì)胞活力，直接體現(xiàn)生物體系生理和生化功能狀態(tài)。

根據(jù)研究對(duì)象和目的不同，代謝組學(xué)分為4個(gè)層次：①代謝物靶標(biāo)分析：對(duì)某個(gè)或某幾個(gè)特定組分的分析；②代謝譜分析：對(duì)一系列預(yù)先設(shè)定的目標(biāo)代謝物進(jìn)行定量分析；③代謝組學(xué)：對(duì)某一生物或細(xì)胞所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析；④代謝指紋分析：對(duì)代謝物整體進(jìn)行高通量的定性分析。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)比較，代謝組學(xué)有以下優(yōu)點(diǎn)：①基因和蛋白的微小變化會(huì)在代謝物上得到放大，從而使檢測(cè)更容易；②不需建立全基因組測(cè)序及大量表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的數(shù)據(jù)庫(kù)；③代謝物的種類要遠(yuǎn)小于基因和蛋白的數(shù)目；④研究中采用的技術(shù)更通用，這是因?yàn)榻o定的代謝物在每個(gè)組織中都是一樣的緣故。

2 代謝組學(xué)分析技術(shù)

代謝組學(xué)的研究過(guò)程包括代謝組數(shù)據(jù)的采集、預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)記物識(shí)別和途徑分析等步驟[7]。首先采集生物樣品(血液、細(xì)胞、組織及培養(yǎng)液等)進(jìn)行生物反應(yīng)滅活、預(yù)處理，然后再運(yùn)用質(zhì)譜法(MS)、氣相色譜法(GC)或核磁共振等檢測(cè)樣品中所有代謝物的種類、含量和狀態(tài)，從而得到大量原始的反映生物樣品星系的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后使用多變量數(shù)據(jù)分析方法對(duì)獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和信息挖掘，從這些信息中篩選出最能反映代謝物變化的主要成分，再根據(jù)代謝物譜在時(shí)程上的變化來(lái)尋找生物標(biāo)記物，進(jìn)而闡述生物體相應(yīng)的代謝機(jī)制。代謝組學(xué)目前研究的主要技術(shù)平臺(tái)是MS和磁共振技術(shù)[8]，主要包括電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、液相色譜—紫外光譜—質(zhì)譜聯(lián)用(LC-UV-MS)、串聯(lián)質(zhì)譜(tandem MS)、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MC)以及核磁共振波譜技術(shù)(NMR)。由于代謝組學(xué)分析對(duì)象的大小、數(shù)量、官能團(tuán)、揮發(fā)性、帶電性、極性以及其他物理化學(xué)性質(zhì)差異很大，要對(duì)它們進(jìn)行無(wú)偏向的全面分析，單一分析手段往往難以勝任。GC以其高分離度、高通量，MS以其普適性、高靈敏度和特異性、NMR技術(shù)特別是1H-NMR以其對(duì)含氫代謝產(chǎn)物的普適性而成為最主要的分析工具。由于LC-MS和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)能分析范圍很廣的代謝組分，因此也是代謝組學(xué)研究分析中的重要工具。

2.1 NMR NMR是有機(jī)結(jié)構(gòu)測(cè)定的四大譜學(xué)之一，利用生物體液的核磁共振波譜提供的生物體內(nèi)全部小分子代謝物的豐富信息，通過(guò)對(duì)這些信息的多元統(tǒng)計(jì)分析和模式識(shí)別處理，了解相關(guān)生物體在功能基因組學(xué)、病理生理學(xué)等方面的狀況和變化，從分子水平來(lái)認(rèn)識(shí)其變化規(guī)律。NMR的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)悠穼?shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性、無(wú)偏向的檢測(cè)，具有良好的客觀性和重現(xiàn)性，樣品處理簡(jiǎn)單，具有較高的通量和較低的單位樣品檢測(cè)成本。1H-NMR對(duì)含氫化合物均有響應(yīng)，能完成樣品中大多數(shù)化合物的檢測(cè)，滿足代謝組學(xué)中的對(duì)盡可能多的化合物進(jìn)行檢測(cè)的目標(biāo)[7]。

2.2 MS MS是一種將分子電離成不同的帶電離子，然后按質(zhì)荷比將其分離、檢測(cè)，進(jìn)而推斷分子結(jié)構(gòu)的方法。它可以檢測(cè)微摩爾濃度的代謝產(chǎn)物，也可以進(jìn)行定量分析，且可以通過(guò)分子量來(lái)推測(cè)代謝產(chǎn)物和進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[8]。目前常用的質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)有GC-MS、LC-MS、毛細(xì)管電泳—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(CE-MS)。GC-MS可以同時(shí)測(cè)定幾百個(gè)化學(xué)性質(zhì)不同的化合物，包括有機(jī)酸、大多數(shù)氨基酸、糖和脂肪酸，具有較高的分辨率和檢測(cè)靈敏度，但GC不能直接得到體系中大多數(shù)難揮發(fā)代謝組分的信息，不能分析不穩(wěn)定物質(zhì)和一些大分子代謝產(chǎn)物，預(yù)處理過(guò)程繁瑣。相對(duì)于GC-MS，LC-MS能分析更高極性和更高相對(duì)分子質(zhì)量的化合物，大多數(shù)情況下不需要對(duì)非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行化學(xué)衍生，非常適合于生物樣本中復(fù)雜代謝產(chǎn)物的檢測(cè)和潛在標(biāo)記物的鑒定。CE-MS可提高代謝產(chǎn)物的檢測(cè)靈敏度和通量，具有高效分離率、微量進(jìn)樣量及快速分析的優(yōu)勢(shì)，其最大優(yōu)點(diǎn)為可在單次分析實(shí)驗(yàn)中分離陰離子、陽(yáng)離子和中性分子，可同時(shí)獲得不同類代謝物的圖譜。

3 代謝組學(xué)對(duì)胚胎發(fā)育潛能的研究

3.1 MS分析胚胎培養(yǎng)液氨基酸濃度與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系 氨基酸參與胚胎發(fā)育的多種重要生理過(guò)程，因此氨基酸代謝水平可在一定程度上反映胚胎的發(fā)育潛能。Houghton等[9]利用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)測(cè)定不同發(fā)育階段胚胎的氨基酸水平，認(rèn)為不同發(fā)育階段胚胎氨基酸的分泌與吸收與囊胚形成有關(guān)，并能預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能。Brison等[10]發(fā)現(xiàn)，甘氨酸、亮氨酸濃度水平降低和天冬氨酸濃度水平升高能夠提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率。有研究表明，胚胎受精后第1～3天培養(yǎng)液氨基酸濃度變化與胚胎的種植潛能有關(guān)[11]，測(cè)定卵裂早期胚胎氨基酸代謝能預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能。

關(guān)于受精后第3～5天胚胎氨基酸代謝水平與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系的研究，有學(xué)者提出胚胎“靜止”假說(shuō)[12]，認(rèn)為有發(fā)育潛能的胚胎其物質(zhì)代謝水平反而低，這可能與有發(fā)育潛能的胚胎受到的損傷小，用于修復(fù)所需的物質(zhì)和能量較少有關(guān)。Houghton等[9]對(duì)8細(xì)胞期到桑葚期胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，此期胚胎氨基酸的消耗量越小，則其發(fā)育成囊胚的潛能越大，未能發(fā)育成囊胚的胚胎在此期消耗的氨基酸是發(fā)育成囊胚的胚胎的2倍。

Sturmey等[13]研究表明，囊胚期胚胎的氨基酸代謝水平與其DNA的損傷程度呈正比。Stokes等[14]通過(guò)檢測(cè)冷凍胚胎復(fù)蘇后的胚胎培養(yǎng)液氨基酸，發(fā)現(xiàn)發(fā)育至囊胚的復(fù)蘇胚胎的培養(yǎng)液氨基酸譜與其先前研究報(bào)道的新鮮胚胎一致，用谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸的轉(zhuǎn)化總量預(yù)測(cè)哪些解凍后胚胎發(fā)育至囊胚，不論解凍后胚胎分級(jí)情況，以此預(yù)測(cè)囊胚形成的準(zhǔn)確率可達(dá)到87%。Brison等[10]回顧性分析多胚胎移植后剩余胚胎培養(yǎng)液的氨基酸，發(fā)現(xiàn)甘氨酸、天冬氨酸和亮氨酸與臨床妊娠率和活產(chǎn)率有關(guān)。

綜上所述，適合胚胎發(fā)育過(guò)程中所需要的氨基酸含量可能會(huì)提高囊胚形成率和臨床妊娠率，非侵入性的氨基酸代謝分析能夠預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能，從而提高胚胎種植率。

3.2 光譜分析技術(shù)對(duì)胚胎發(fā)育潛能的評(píng)價(jià)作用 常用的光譜分析技術(shù)主要有近紅外(NIR)光譜分析技術(shù)、傅立葉變換紅外(FTIR)光譜分析技術(shù)和Raman光譜技術(shù)等。每種化學(xué)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定其暴露射線時(shí)吸收射線增加的振動(dòng)能量和振動(dòng)特征頻率，通過(guò)檢測(cè)其吸收電磁射線的強(qiáng)度和波長(zhǎng)位置，進(jìn)而確定其相應(yīng)的分子功能基團(tuán)，如O-H、R-H、S-H和N-H,能對(duì)多種樣品進(jìn)行快速無(wú)創(chuàng)定量定性分析。一項(xiàng)多中心參與的前瞻性研究表明，應(yīng)用紅外光譜分析技術(shù)測(cè)定D3胚胎移植后的培養(yǎng)基中的胚胎代謝成分與妊娠率相關(guān)。光譜圖顯示妊娠胚胎和非著床胚胎存在顯著不同，主要表現(xiàn)為-NH、-CH和-OH的濃度存在明顯差異，這些差異的光譜區(qū)域經(jīng)專業(yè)多線性回歸軟件定量分析后轉(zhuǎn)換為單個(gè)胚胎的活力指數(shù)，結(jié)果顯示著床胚胎平均活力指數(shù)明顯高于未著床胚胎[15]。

Seli等應(yīng)用紅外光譜技術(shù)與遺傳學(xué)算法，建立了一套可準(zhǔn)確獲得不同發(fā)育階段的胚胎的代謝譜和活力指數(shù)的預(yù)測(cè)軟件模型，認(rèn)為活力指數(shù)高的妊娠結(jié)局明顯好于活力指數(shù)低的胚胎，且與胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分無(wú)關(guān)[16]。進(jìn)一步的研究表明，胚胎代謝組活力指數(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)估方法比單用胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估方法預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局準(zhǔn)確性更高[17]。

3.3 NMR技術(shù)在評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育潛能的研究 NMR分析技術(shù)是基于原子核的磁特性對(duì)生物體液或組織進(jìn)行無(wú)創(chuàng)多變量分析，利用核磁共振譜圖自動(dòng)提供代謝物的結(jié)構(gòu)及數(shù)量信息。Seli等[18]利用H-NMR分析技術(shù)回顧性比較妊娠組胚胎培養(yǎng)液和未妊娠組胚胎培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)兩組圖譜顯著不同，H-NMR技術(shù)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能的敏感度和特異性均達(dá)到88.2%。Chertkov等用H-NMR技術(shù)分析第5天不同形態(tài)的囊胚培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)每例NMR光譜可區(qū)別出葡萄糖、丙酮酸、乳酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、及谷氨酸，研究結(jié)果表明胚胎的發(fā)育潛能與不同胚胎的代謝物含量相關(guān)。

4 小結(jié)

代謝組學(xué)作為一種新興的技術(shù)與方法，在輔助生殖技術(shù)中具有很好的應(yīng)用前景。胚胎的發(fā)育和代謝是個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，不同發(fā)育階段胚胎的檢查結(jié)果和不同技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果可能不大相同，需要對(duì)不同發(fā)育階段的胚胎代謝產(chǎn)物應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行大樣本分析。與現(xiàn)在常用的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估方法相比，代謝組學(xué)技術(shù)能客觀、全面、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)地反映胚胎的發(fā)育潛能，可作為胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估的補(bǔ)充，從而提高胚胎種植率，提高單胚胎移植的妊娠率。

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江蘇省婦幼保健科研項(xiàng)目(F201347)；南通市科技計(jì)劃項(xiàng)目(HS2013012)。

丁家怡

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.043

R711.6

A

1002-266X(2015)01-0098-03

2014-08-07)