■劉雙鳴劉敏躍李 鵬 龍 淼 張 燚何劍斌

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機械研究所有限公司，遼寧沈陽 110036）

圍產(chǎn)期是指奶牛產(chǎn)前2～3周至產(chǎn)后2～3周這一時期，此期間奶牛各種疾病的發(fā)生率顯著升高，如產(chǎn)后癱瘓、胎衣不下、子宮炎、酮病、皺胃變位、跛行、臨床型乳房炎等[1]。圍產(chǎn)期奶牛干物質(zhì)采食量（DMI）明顯下降，而此時由于胎兒和泌乳的需要，機體對能量的需求增加，使得奶牛處于一個能量負平衡（NEB）階段。因此，此時奶牛為了適應(yīng)NEB，通過大量動員體脂來滿足機體對能量的需求[2]。而代謝改變?nèi)缰緞訂T等通常都伴隨著炎癥反應(yīng)以及免疫功能的變化。雖然已有報道顯示脂肪動員和圍產(chǎn)期奶牛免疫功能障礙有關(guān)，但具體機制尚不清楚。

1 脂肪運員

脂肪動員是一種哺乳動物在可利用能量減少的情況下獲得營養(yǎng)來源的一種生理適應(yīng)反應(yīng)，是脂肪組織內(nèi)脂肪生成與脂類分解的失衡的現(xiàn)象。脂肪生成最初是甘油二酯的合成，隨后通過添加一個脂肪酸分子最終形成甘油三酯（TG）分子。脂肪組織中的脂解酶主要包括激素敏感脂肪酶、脂肪甘油三酯脂肪酶、單酰甘油脂肪酶等，主要負責(zé)啟動TG分解成甘油和NEFA。在整個圍產(chǎn)期，脂肪分解受一系列激素水平變化的影響，包括血漿胰島素水平降低，脂肪和其他外周組織中胰島素敏感性受損，以及血漿生長激素和糖皮質(zhì)激素改變等。

圍產(chǎn)期奶牛脂肪分解增加最終的結(jié)果是血漿游離脂肪酸濃度升高。事實上，血漿游離脂肪酸水平可通常作為評估圍產(chǎn)期奶牛NEB程度的標(biāo)準(zhǔn)。在泌乳后期和干奶期，NEFA平均小于0.2 mmol/l。NEFA水平開始在分娩前2周內(nèi)增加，峰值通常在產(chǎn)后0～10 d出現(xiàn)，濃度高時可超過0.75 mmol/l[3]。如果奶牛發(fā)展形成酮病，NEFA濃度可超過1.0 mmol/l。與之相反，伴隨血液中NEFA濃度增加，其他血脂成分如磷脂（PL）和TG在分娩后的第1周內(nèi)濃度降低。干奶期血漿TG濃度通常為200 μM，而在分娩后的10 d內(nèi)通常下降至50 μM，而PL也由產(chǎn)前的200 μM下降至120 μM[4-5]。因此，圍產(chǎn)期脂肪分解增強不僅增加血漿游離脂肪酸濃度，也改變了脂肪酸血漿脂質(zhì)成分的比例。

2 NEFA的代謝

脂肪動員產(chǎn)生的NEFA可以作為能量底物被不同組織細胞利用，諸如白細胞和內(nèi)皮細胞等。NEFA在通過不同機制轉(zhuǎn)運進入細胞質(zhì)后，有多種代謝途徑。如作為能量底物在線粒體發(fā)生β-氧化反應(yīng)，也可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器作為合成代謝的底物。當(dāng)用作能量底物時，脂肪酸首先要在脂酰輔酶A合成酶的催化下合成脂酰輔酶A[6]。研究表明，多種動物的白細胞均可以表達不同亞型的脂酰輔酶A合成酶。人類單核細胞表達中鏈脂酰輔酶A合成酶和脂酰輔酶A結(jié)合蛋白。而小鼠淋巴細胞也能夠表達特定的脂酰輔酶A合成酶。同樣，內(nèi)皮細胞也可同時表達脂酰輔酶A合成酶和脂酰輔酶A結(jié)合蛋白，從而促進NEFA的利用[7,8]。目前，圍產(chǎn)期奶牛代謝改變對其內(nèi)皮細胞和白細胞的脂酰輔酶A合成酶和結(jié)合蛋白表達的影響尚不清楚。

當(dāng)游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為酰基輔酶A后，可借助于脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）的作用被運送到特定的細胞器進行代謝。白細胞和內(nèi)皮細胞均表達有FABP的不同亞型。例如，單核細胞和巨噬細胞表達FABP3和FABP4，樹突狀細胞也可表達FABP3、FABP4，而淋巴細胞表達FABP5[9,10]。脂肪酸與特定的FABP結(jié)合，可以進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進行代謝，如合成磷脂等。脂肪酸也可以與細胞內(nèi)某些特殊的受體結(jié)合來調(diào)節(jié)某些基因的表達，如過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）等。PPARs及其配體（飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和其他脂質(zhì)介質(zhì)）可以調(diào)節(jié)多種細胞的炎癥反應(yīng)，包括內(nèi)皮細胞、單核細胞和脂肪細胞等。

3 NEFA對白細胞和內(nèi)皮細胞功能的影響

圍產(chǎn)期內(nèi)奶牛脂肪動員改變血漿游離脂肪酸濃度和成分。許多研究人員對脂肪動員期間的奶牛白細胞和內(nèi)皮細胞功能活動的變化進行了相應(yīng)研究。例如，Lacetera等[11]報道當(dāng)奶牛血漿游離脂肪酸濃度的升高時，其外周血單核細胞（PBMC）的DNA合成、IFN-γ分泌以及IgM合成均減少，同時中性粒細胞的功能和活力也受到影響，活性氧簇（ROS）的合成增加。血漿NEFA的含量和組成并不是影響白細胞的功能的唯一因素，NEFA的作用時間也起著關(guān)鍵作用。對人的研究表明，延長高濃度NEFA的處理時間（超過24 h）可以顯著增強單核細胞炎性反應(yīng)，主要包括細胞表面表達的粘附分子β整合素等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)[12]。而這些變化可增強單核細胞對內(nèi)皮細胞的粘附能力，可能是導(dǎo)致人動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。

盡管近年來對奶牛圍產(chǎn)期脂肪動員的研究取得了一些進展，但鮮有關(guān)于脂類代謝與白細胞和內(nèi)皮細胞功能變化之間聯(lián)系的報道。人類和嚙齒類動物的研究表明，脂肪動員可通過幾種不同途徑影響炎癥反應(yīng)狀態(tài)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和白細胞的功能改變。其直接作用方式主要是脂毒性，間接方式主要包括脂肪酸對細胞內(nèi)信號的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等。

3.1 脂毒性

脂類在非脂肪細胞的細胞質(zhì)中蓄積被定義為異常的脂肪沉積或脂肪變性。最常見的與脂肪變性相關(guān)的脂類代謝產(chǎn)物主要包括NEFA及其相應(yīng)的脂酰輔酶A、甘油二酯、甘油三酯等，而此過程在人類肝臟、骨骼肌、胰腺、心臟和血管組織均可發(fā)生。對奶牛而言，脂肪肝是脂肪變性最常見的一種形式，其發(fā)生時總是伴隨著劇烈的脂肪動員[13]。TG及其他脂質(zhì)代謝產(chǎn)物在肝細胞和其他細胞的過度沉積，可以壓縮和減少其他細胞器的大小和數(shù)量，可能導(dǎo)致相應(yīng)器官功能受損。

NEFA和其他脂類代謝產(chǎn)物的蓄積產(chǎn)生的第二種后果主要是誘導(dǎo)程序性細胞凋亡。雖然對于白細胞尚未見此類報道，但在心肌細胞和胰島B細胞均有類似報道[14]。NEFA及其脂酰輔酶A可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡，該過程主要以蛋白質(zhì)翻譯過程減緩、蛋白質(zhì)折疊能力增強、蛋白質(zhì)降解加速等為特點。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能持續(xù)紊亂，細胞最終將啟動凋亡程序[15]。已經(jīng)證實，棕櫚酸和油酸可以在嚙齒類動物胰腺細胞中通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)細胞凋亡，而二者正是奶牛血液中NEFA的主要成分[16]。

3.2 NEFA對胞內(nèi)信號的影響

NEFA及其相應(yīng)的脂酰輔酶A可以通過直接與特異性受體結(jié)合，或間接地改變某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，從而實現(xiàn)對細胞信號通路的調(diào)節(jié)。報道顯示，奶牛白細胞、肝細胞和脂肪細胞的細胞膜磷脂層中棕櫚酸的含量在圍產(chǎn)期顯著增加，而高水平的棕櫚酸可以顯著促進圍產(chǎn)期奶牛白細胞的活化。但當(dāng)棕櫚酸被二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DHA）等ω-3多不飽和脂肪酸替代時，T細胞的活化延遲。而在圍產(chǎn)期奶牛細胞膜磷脂成分中EPA和DHA的含量均降低[17-18]。

諸如棕櫚酸和硬脂酸等飽和游離脂肪酸及其相應(yīng)的酰基輔酶A，可以直接激活NF-κB的信號通路。NF-κB可以誘導(dǎo)幾種黏附分子轉(zhuǎn)錄，包括：內(nèi)皮白細胞黏附分子（ELAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子（ICAM1），E-選擇素等[19-20]。NF-κB也可誘導(dǎo)諸多細胞因子、趨化因子及其受體的表達，增強細胞的炎癥反應(yīng)。

飽和脂肪酸能夠激活Toll樣受體-4（TLR-4），并借此啟動NF-κB信號傳導(dǎo)通路[21]。TLR-4活化可損害內(nèi)皮細胞對胰島素的敏感性，導(dǎo)致一氧化氮的產(chǎn)量增加。在奶牛分娩后，血漿胰島素濃度降至最低點，這可以增強TLR-4的促炎活力[22]。在諸如乳腺炎、子宮炎等圍產(chǎn)期奶牛常見疾病發(fā)生過程中，脂肪動員引發(fā)的TLR表達變化可能與奶牛過度的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

飽和脂肪酸還可以直接激活細胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。最近的一項研究表明，棕櫚酸可以啟動人血管內(nèi)皮細胞p38 MAPK信號活化，誘導(dǎo)細胞凋亡，并呈劑量依賴性[23]。最近的研究也證實[24]，過渡期奶牛發(fā)生鏈球菌乳腺炎時某些MAPK通路相關(guān)基因表達下調(diào)，但脂肪動員對MAPK信號通路的影響尚需深入研究。

3.3 氧化應(yīng)激

人體內(nèi)研究表明，血漿游離脂肪酸可以增強白細胞和內(nèi)皮細胞活性氧和活性氮產(chǎn)量[25]?；钚匝跏莵碓从诜肿友鹾统蹶庪x子，在線粒體電子傳遞鏈或NADPH氧化酶的作用下合成。同樣，活性氮（RNS）主要來源于一氧化氮合成酶催化合成一氧化氮的過程中。在線粒體中，NEFA可以通過減緩線粒體電子傳遞鏈以及促進脂肪酸β-氧化代謝過程等兩種方式增加ROS的產(chǎn)量。對于圍產(chǎn)期奶牛，脂肪動員加劇，血液中NEFA含量升高，因此，可以通過以上兩種途徑顯著增加其ROS的產(chǎn)量。此外，圍產(chǎn)期奶牛尤其是過肥的奶牛機體抗氧化防御能力降低[26]。研究表明，某些類型的脂肪酸可以提高β-氧化過程中活性氧的生產(chǎn)，如棕櫚酸，與丙酸和蘋果酸等其他氧化底物相比，棕櫚酸可產(chǎn)生大量的超氧化物[27]。而ROS和RNS濃度的增加可以導(dǎo)致白細胞的功能及其有效免疫防御能力受損。

4 結(jié)語

綜上所述，能量負平衡引發(fā)的圍產(chǎn)期奶牛代謝變化，尤其是脂肪動員，不僅可以影響奶牛能量代謝，也可影響其炎癥反應(yīng)狀態(tài)和免疫功能。脂肪動員可以打破炎癥發(fā)展與消退之間的平衡，可能加劇諸如乳腺炎、子宮炎、蹄葉炎等圍產(chǎn)期奶牛常見疾病過程中的炎癥反應(yīng)。此外，血液NEFA濃度和成分的改變也可能直接影響白細胞活力從而提高機體對疾病的易感性。因此，在圍產(chǎn)期奶牛飼養(yǎng)管理過程中，限制奶牛脂肪動員，增加干物質(zhì)攝入，確保充足的多不飽和脂肪酸的攝入有利于增強機體免疫防御能力，從而控制圍產(chǎn)期奶牛常見疾病的發(fā)生。