姜偉華，李善剛，陳學進

（上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部，上海 200025）

·綜述·

ApoE基因功能及相關疾病模型的研究進展

姜偉華，李善剛，陳學進

（上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部，上海 200025）

載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）基因位于人類第19號染色體上，全長3.7 kb，表達產(chǎn)物載脂蛋白是一種富含精氨酸的堿性蛋白。apoE蛋白參與脂質(zhì)的運輸、儲存及排泄，同時也參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷后的修復。目前人類高發(fā)的動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病均與apoE蛋白參與的脂代謝調(diào)節(jié)異常有關，體外及動物實驗研究表明，APOE基因的多態(tài)性與冠心病、高脂血癥、腦梗塞的發(fā)生相關。研究制作APOE轉(zhuǎn)基因及基因敲除或突變的相關動物模型，探明其脂代謝過程，可以更好地了解上述疾病的發(fā)病機制，尋找相關疾病的潛在治療靶點，從而為治療人類疾病提供更加可行有效的方案。本文總結了人類APOE基因型與apoE蛋白相關的幾種疾病發(fā)生機制，并對體外研究疾病發(fā)展過程的動物模型進行了綜述。

載脂蛋白E（apoE）；疾病模型；轉(zhuǎn)基因動物；基因敲除

載脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）是一種多功能糖蛋白，最早由Shore等［1］于1973年在正常人的極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）中發(fā)現(xiàn)，主要在肝臟、腦組織及巨噬細胞中合成和分泌，是血漿VLDL、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和乳糜微粒（chylomicron，CM）等脂蛋白的重要組分，能夠與VLDL結合，通過血漿膽固醇、甘油三酯的運輸影響脂蛋白代謝，維持血脂平衡，參與心血管功能的調(diào)節(jié)。同時APOE基因的多態(tài)性在血漿膽固醇水平中起重要作用，是心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的一個重要的分子靶標［2］。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中，apoE蛋白是膽固醇、磷脂及硫脂類運輸?shù)恼{(diào)節(jié)劑和突觸發(fā)生的促進劑，其表達影響著神經(jīng)中樞的調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟［3，4］?；赼poE蛋白的重要作用，其表達調(diào)控和表達類型與冠心?。╟oronary heart disease，CHD）、高脂血癥（hyperlipidaemia，HLP）、腦梗塞（cerebral infarction）、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、阿爾茨海默病（alzheimer disease，AD）等疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的聯(lián)系。

因此，開展關于APOE基因功能的相關研究，可以幫助人類更加深入地了解與此相關的諸如CHD、HLP、AS、AD、腦梗塞等疾病的發(fā)病機制，并借助相關動物模型模擬疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從而找到治療相關疾病的有效方案。

1　ApoE基因及表達產(chǎn)物分型

現(xiàn)已知APOE基因位于人類第19號染色體長臂13區(qū)2帶（19q132）上，長3.7 kb，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子［5］。APOE基因位點有3個等位基因，分別為ε2、ε3、ε4，在一般人群中所占比例分別為8%，78%，14%［1，6］，其中APOE ε3是野生型基因，ε2和ε4是基因突變的結果。APOE基因可以產(chǎn)生6種常見基因型，即三種純合子型APOE ε2/ ε2、ε3/ε3、ε4/ε4和三種雜合子型APOE ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4。APOE基因頻率和表型分布存在種族間和地區(qū)間差異，但無性別間差異。另外apoE蛋白具有三種不同的亞型（isoform），分別為apoE2蛋白、apoE3蛋白、apoE4蛋白，三者的主要區(qū)別在于112位的半胱氨酸和158位的精氨酸。apoE3蛋白是普通的亞型，其112位為半胱氨酸，158位為精氨酸；apoE2蛋白的112位和158位均為半胱氨酸；apoE4蛋白的兩個位置都是精氨酸，每兩種亞型之間只有一個氨基酸發(fā)生變化［7］。apoE蛋白的多態(tài)性具有重要的生物學特性，多年來先后采用等點聚焦電泳法、免疫印跡法、雙相電泳法和基因分析技術來對其進行檢測。

APOE基因的cDNA長1.163 kb，其表達產(chǎn)物apoE蛋白主要在肝臟和腦組織中合成，也可以在脾、腎上腺、卵巢顆粒細胞及巨噬細胞中合成?；虻淖畛醍a(chǎn)物為含317個氨基酸的蛋白質(zhì)，其所含的一個18個氨基酸的信號肽被裂解后，變成由299個氨基酸組成的成熟蛋白，其中含有32個精氨酸和12個賴氨酸。由于精氨酸含量高達11%，所以apoE是一種富含精氨酸的堿性蛋白。apoE蛋白的二級結構由α螺旋、β片層、β轉(zhuǎn)角和不規(guī)則結構四部分組成，凝血酶可以將apoE分子水解成兩個相對獨立的區(qū)域: N-端區(qū)和C-端區(qū)。N-端區(qū)（1～191）為分子量22 000的可溶性蛋白，此區(qū)域較穩(wěn)定，該片段的136～158位肽段為受體結合位點，能與低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein-receptor，LDL-R）以及LDL-R相關蛋白緊密結合，該區(qū)域富含的堿性氨基酸在受體結合中起重要作用，一旦被改變，其受體結合能力顯著下降，同時該區(qū)域也屬于肝素結合區(qū)；C-端區(qū)（216～299）分子量為10 000，螺旋程度高，不穩(wěn)定，是脂蛋白結合區(qū)［8］。這兩個結合域由一段鉸鏈區(qū)（165～215位肽段）相連。ApoE蛋白異構體常發(fā)生在中段（112～158位氨基酸殘基），這些突變幾乎均可導致各種HLP和其他疾病，這也充分說明該區(qū)段的重要性［9］。

2　ApoE功能及分類

apoE作為一種膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白，對形成HDL、中間密度脂蛋白（intermediate density lipoprotein，IDL）、VLDL和CM及維持其穩(wěn)定具有極為重要的作用。同時它還是一個多功能的分子，可以在細胞生長、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、糖代謝、神經(jīng)元的生長和修復、突觸結構維持、營養(yǎng)支持以及調(diào)節(jié)機體炎癥應答反應等生物學過程中發(fā)揮作用［6，10］，又可以在免疫調(diào)節(jié)方面對機體產(chǎn)生影響［11］，并且可以作為配體與LDL-R和apoE受體結合，也是肝細胞CM殘粒受體的配體。apoE通過與這些受體相互作用介導CM、VLDL及其殘粒在循環(huán)系統(tǒng)中的清除，在膽固醇的轉(zhuǎn)運、吸收和再分配的過程中發(fā)揮重要作用。當apoE發(fā)生單一氨基酸的取代時，將導致VLDL-LDL轉(zhuǎn)化速率和細胞對膽固醇吸收速率的改變，從而影響血脂水平。

同apoE3、apoE4相比，apoE2對LDL-R親和力下降100倍，APOE ε2/ε2基因型的個體轉(zhuǎn)化VLDL-LDL的速率和吸收食物膽固醇的速率緩慢，而靠細胞內(nèi)膽固醇濃度調(diào)節(jié)的LDL-R的表達將受到代償性上調(diào)，結果導致血中VLDL殘體濃度升高和LDL水平下降。相反，APOE ε4/ε4基因型的個體由于受體結合區(qū)域為堿性氨基酸，apoE受體結合活性明顯增高，能夠迅速轉(zhuǎn)化VLDL和吸收食物中的膽固醇，其結果下調(diào)LDL-R的表達，最終導致血中低水平的VLDL和高水平的LDL［12］。

3　ApoE相關疾病

隨著許多學者對APOE基因多態(tài)性的深入研究，APOE基因發(fā)生突變可以影響血脂的代謝和利用，從而導致一系列相關疾病的發(fā)生［2］。研究顯示［13］APOE ε4等位基因與淀粉樣血管病變導致的腦出血的愈后及再出血有關，同時該等位基因也是AD和AS的共同危險因素，可以導致HLP、CHD、腦梗塞等臨床疾病，另外它也與老年人收縮期高血壓與胰島素抵抗等有一定的關系。

3.1ApoE與AD

AD是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病。它指的是一種持續(xù)性高級神經(jīng)功能活動障礙，即在沒有意識障礙的狀態(tài)下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認、情緒等方面的障礙。AD可以分為多見的、散發(fā)性及少數(shù)有家族遺傳史的家族性疾病。根據(jù)首發(fā)年齡是否晚于65歲可將其分為早發(fā)性AD和遲發(fā)性AD。AD的主要病理特征為在病變部位有老年斑（senile plaques，SP），其主要成分是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）水解生成的β-淀粉樣肽（amyloid βpeptide，Aβ）組成，而退變的神經(jīng)軸突圍繞β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，β-AP）形成SP，神經(jīng)原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFT）存在于病變部位的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，主要組成是聚集成雙螺旋細絲的過度磷酸化的微管相關Tau蛋白，并且神經(jīng)細胞可以選擇性丟失［8］。該病具有家族發(fā)病傾向，但在普通人群中也有散發(fā)病例。

研究表明［14］，AD的發(fā)生可能是由于膽固醇及apoE蛋白通過Aβ機制的影響。膽固醇水平升高是AD的易感因素［15］，apoE蛋白可以通過調(diào)節(jié)中樞或外周膽固醇代謝而影響AD發(fā)病的易感性。Aβ是含39～43個氨基酸殘基的異質(zhì)多肽，由β-和γ-分泌酶分別裂解β-APP后產(chǎn)生。Strittmatter等［16］于1993年首先報道了apoE蛋白可與Aβ緊密結合，并且首次發(fā)現(xiàn)APOE ε4等位基因是AD的主要風險因素。在APOE三種等位基因中，APOE ε2與APOE ε3相比具有更低的致病風險性，有助于避免AD發(fā)生，而APOE ε4比APOE ε3更容易導致AD發(fā)生，并與AD發(fā)病風險性呈比例相關效應，即隨著APOE ε4基因比例的增加，患者的發(fā)病年齡逐漸降低［5］，認知功能受到不同程度的損害，并能抑制神經(jīng)突觸的生長，AD患者成熟的SP核心出現(xiàn)異常的膽固醇積累［10，17］。apoE蛋白三種亞型調(diào)節(jié)膽固醇從神經(jīng)元細胞流出的能力（apoE4＜apoE3＜apoE2）與AD危險性呈負相關。2007年Bertram證實［18］，apoE4蛋白與β-AP結合異常，影響其有效的清除，致使β-AP沉積異常積聚，從而導致AD的發(fā)生。

3.2ApoE與AS

AS是全身彌漫性疾病，是心腦血管疾病的最主要病因，主要病變特征為動脈某些部位的內(nèi)膜下有脂質(zhì)等沉積，并伴有平滑肌細胞成分的增殖，逐步發(fā)展形成動脈粥樣硬化性斑塊。斑塊部位的動脈壁增厚、變硬，局部形成隆起的病灶，內(nèi)膜纖維結締增生，內(nèi)部組織壞死崩解后與沉積的脂質(zhì)結合，將其圍起、固定，形成粥樣斑塊，稱為粥樣硬化。apoE蛋白多態(tài)性的生化結構的差異影響其脂質(zhì)代謝的不同，而apoE4獨特的結構域相互作用可能是個體水平和動脈粥樣硬化的分子基礎。apoE4蛋白與VLDL的優(yōu)先結合導致VLDL及其殘粒的有效清除，從而反饋性地下調(diào)肝細胞表面低密度膽固醇受體的表達，使肝細胞對低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的攝取量減少，最終導致血漿中LDL-C清除速率下降，使血漿LDL-C水平升高，從而增加AS發(fā)生的危險性。而APOE ε2等位基因作為保護因子對冠狀AS的發(fā)展有保護作用［19］。

唐春萍等［20］研究表明，缺乏apoE蛋白將導致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)沉積和浸潤，從而通過多種途徑影響或?qū)е翧S的形成。血脂代謝紊亂，主要指膽固醇、LDL、甘油三酯超出正常范圍和（或）HDL低下。甘油三酯水平升高導致AS的顆粒變小，密度較大的LDL產(chǎn)生增加，凝血因子Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅹ水平增加，組織型纖溶酶原激活劑活性降低，胰島素水平升高，胰島素抗性增加，這些都能增加AS的發(fā)生率。另外，LDL水平升高使血管內(nèi)皮下LDL的氧化修飾加強，并且在LDL氧化修飾過程中形成的溶血磷脂酸能與細胞膜上相應的G蛋白偶聯(lián)受體結合，導致內(nèi)皮細胞骨架纖維收縮，形成細胞間通道，增加內(nèi)皮的通透性，使血液中LDL易于通過而沉積于內(nèi)皮下間隙，增加了氧化型LDL（oxidized LDL，OxLDL）的產(chǎn)生。OxLDL可以刺激內(nèi)皮細胞分泌單核細胞趨化蛋白（MCP-1）、血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1（VCAM-1）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1），使巨噬細胞聚集至病灶部位，并且向內(nèi)皮下遷移。同時OxLDL可以刺激單核/巨噬細胞高表達清道夫受體CD36，從而使其大量吞噬OxLDL，形成泡沫細胞［21］，泡沫細胞破裂釋放出大量膽固醇，最終成為粥樣斑塊脂質(zhì)核心的主要成分，促進AS的形成。

2006年李朝輝等［22］通過實驗證明，兔ApoE基因可在其主動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細胞源性和平滑肌細胞源性的泡沫細胞中表達，與AS的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關。apoE蛋白導致動脈粥樣硬化性腦梗死機制是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中膽固醇的動員和再分配，從而顯著升高總膽固醇濃度，使之易患AS，進而易發(fā)展為動脈粥樣硬化性腦梗死。

3.3ApoE與CHD

CHD是指因冠狀動脈官腔狹窄、阻塞和（或）功能改變（痙攣）而導致心肌缺血、缺氧或壞死的心臟病。它是由遺傳和環(huán)境危險因素共同作用而發(fā)病的多基因遺傳性疾病。CHD不僅表現(xiàn)為心血管性疾病及血液動力學異常，而且同時存在著免疫、內(nèi)分泌及多種物質(zhì)代謝等障礙。近年來隨著對CHD研究的深入，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過200種危險因素可以導致該病的發(fā)生，其中血脂異常是研究最多，并且被認為是與CHD的發(fā)生、發(fā)展密切相關的危險因素［23］。流行病學調(diào)查和臨床研究資料都表明［6］，血漿LDL-C水平與CHD的危險性呈正相關，血漿高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平與CHD的發(fā)病危險性呈負相關。有研究表明［24］，甘油三酯水平升高已經(jīng)成為CHD的一項獨立危險因素，而各種降低甘油三酯的干預措施對降低CHD患者的患病率、病死率及愈后改善具有明顯的療效。APOE基因的多態(tài)性是影響血漿膽固醇濃度的重要遺傳因素，不同表型的APOE基因與脂蛋白的結合能力存在一定的差異，即APOE基因多態(tài)性影響血脂水平。Anna的研究結果表明［25］，APOE基因型與罹患冠心病呈線性相關，APOE ε2等位基因的一般作用是降低膽固醇濃度，所以APOE ε2基因攜帶者患CHD的風險比ε3/ε3基因型人群低20%左右，而APOE ε4基因攜帶者的患病風險則相對較高。因此，APOE基因多態(tài)性檢測有望成為CHD的早期預防、篩查、診斷、檢測和干預治療的指標之一，進而具有重要的臨床意義。

3.4ApoE與HLP

HLP是指脂肪代謝或轉(zhuǎn)運異常使血漿中總膽固醇和/或甘油三酯水平過高，或HDL-C水平過低而表現(xiàn)出的一種血脂異常。它是一種較為常見的疾病，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性高脂血癥兩種。原發(fā)性高脂血癥是因遺傳缺陷或環(huán)境因素相互作用而引發(fā)的，常伴有家族遺傳性；繼發(fā)性高脂血癥是由全身性疾病導致，在原發(fā)疾病治愈后脂蛋白代謝紊亂可以得到糾正，相較原發(fā)性高脂血癥更為多見。高脂血癥特別是高水平的LDL-C是AS的主要危險因子，而APOE基因是決定膽固醇水平的最重要的遺傳因素之一。

血漿膽固醇60%的變異是由遺傳因素決定的，而其中約有14%～16%是來自于APOE基因的多態(tài)性［26］。APOE基因缺陷患者易患HLP。apoE蛋白作為脂蛋白的配體以及結構與功能蛋白對血脂代謝起著重要作用，其中apoE2蛋白與LDL-R親和力較低，因此含apoE2蛋白的VLDL殘基從血漿中的清除速度緩慢，導致LDL-R上調(diào)，最終導致LDL-C水平下降并降低膽固醇血脂。apoE4蛋白水平升高，導致VLDL清除速度加快，致使LDL-R下調(diào)出現(xiàn)高膽固醇血癥。HLP是CHD確切的危險因素之一，APOE ε4等位基因?qū)π哪X血管疾病發(fā)病的作用機制可能是通過升高膽固醇、LDL-C和apoE蛋白水平進而促進動脈粥樣硬化而產(chǎn)生作用的。

4　ApoE基因相關的動物模型

目前國內(nèi)、外對APOE基因功能的研究主要是利用轉(zhuǎn)基因動物或者基因敲除或突變的動物，建立相關的動物模型，為探索APOE基因與相關疾病的預防、治療和機理研究提供了有效的手段。

4.1ApoE轉(zhuǎn)基因動物

自從Jaenish等于1974年成功制備出第一只轉(zhuǎn)基因小鼠，1982年Palmiter等首次將這一技術應用于醫(yī)學研究后，轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）迅速在多個醫(yī)學領域中得到了應用。目前已經(jīng)在羊、豬、雞、兔、魚、大鼠、小鼠等動物中成功構建轉(zhuǎn)基因模型。

1990年Simonet等［30］觀察到人APOE基因成功在轉(zhuǎn)基因鼠的心、腎、腦中表達。隨后人APOE ε3等位基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中成功表達，并出現(xiàn)異常脂蛋白水平。2011年薛越強等［31］觀察到ApoE ε4等位基因在轉(zhuǎn)基因鼠的腎臟中有高表達，在腦和心臟中有中等程度的表達，在肝臟中的表達最少，而在脾臟中則沒有表達。過表達ApoE的轉(zhuǎn)基因小鼠血漿膽固醇與甘油三酯水平降低，引發(fā)高膽固醇血癥，ApoE基因在AD疾病小鼠模型的表達降低了β-AP的聚集，而低表達ApoE的小鼠模型用于動脈粥樣硬化與神經(jīng)退行性疾病研究。人脂蛋白失調(diào)癥的ApoE突變基因ApoE3-Leiden的轉(zhuǎn)基因小鼠在飼喂普通飼料時，血漿膽固醇和甘油三酯水平增高，使得ApoE3-Leiden變異蛋白構成HDL；在飼喂高脂飼料時，血漿膽固醇和甘油三酯濃度更高，容易誘發(fā)脂肪肝并改變肝VLDL的分泌。在ApoE2轉(zhuǎn)基因鼠中，當ApoE2基因適當表達時，血漿總膽固醇和LDL-C降低，而甘油三酯水平升高，在沒有遺傳和環(huán)境因素的影響下，ApoE2有降低膽固醇發(fā)揮抗AS的作用，而ApoE4則能升高膽固醇導致AS。

周厚清等［32］通過cDNA微陣列的研究發(fā)現(xiàn)，由于人APOE轉(zhuǎn)基因的影響，轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的一些與生物氧化和炎性細胞因子相關的基因表達加強，導致轉(zhuǎn)基因小鼠面對很大的氧化壓力，而自由基介導的脂質(zhì)過氧化反應加快是形成AS斑塊的原因之一。

轉(zhuǎn)基因大鼠過表達apoE基因可以通過受體途徑顯著增強血漿VLDL、LDL和CM的代謝［33］。與apoE3蛋白相比，apoE4蛋白優(yōu)先與VLDL結合并表現(xiàn)出更強的受體結合活性。因此，攜帶ε4等位基因的人群更易患AS等心血管疾病。

4.2基因敲除或突變動物

基因敲除（gene knockout）技術是1980年代后半期應用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術。它是指應用一定的方法和手段，在體外構建特殊的載體，通過同源重組的方式，刪除一個結構已知但功能未知的基因，在細胞水平或動物個體水平觀察該基因的功能。迄今為止，基因敲除技術已經(jīng)幫助人們構建了數(shù)千個人類疾病的小鼠模型，包括心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥等疾病模型。由于很多疾病都與基因變異有關，因此構建相應的基因敲除動物模型，通過對這些模型的研究，找到治療相關疾病的潛在方法，為研究治療人類疾病提供了一個有效的途徑［34］。

ApoE基因敲除小鼠（ApoE-knockout mice）［35，36］，亦稱ApoE基因缺陷小鼠（ApoE defective mice），是由美國洛克菲勒大學生化遺傳與代謝實驗室和北卡羅萊那大學病理遺傳實驗室在1992年應用胚胎干細胞基因敲除技術獲得的，即在小鼠胚胎細胞中通過基因重組的方法，把ApoE基因從小鼠胚胎細胞的基因組中敲除，使內(nèi)源ApoE基因遭受破壞，不能表達，因而導致VLDL和CM積累，脂蛋白清除產(chǎn)生障礙，從而使發(fā)育的小鼠無法表達ApoE蛋白。當用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠時，小鼠老化程度很快，皮膚上出現(xiàn)肥胖條紋［37］，皮下出現(xiàn)纖維瘤和復合斑塊，血中膽固醇含量增高并在主動脈和冠狀動脈堆積，從而動脈出現(xiàn)粥樣硬化等［38］。另外，ApoE基因敲除小鼠的巨噬細胞、T細胞和平滑肌細胞的生理反應與人類心血管疾病中的反應極為相似。因此，這更加證明ApoE基因在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要性，同時也為研究心血管疾病提供了一種有效的動物模型。

此外，ApoE基因敲除小鼠的學習和記憶能力明顯下降［39］，這可能是由于乙酰膽堿類物質(zhì)供給不足造成的，而且在ApoE基因敲除小鼠中，血腦屏障的通透性很容易被破壞，導致一些非必需小分子化合物進入大腦，造成大腦功能的部分紊亂。人類APOE ε3和ε4等位基因轉(zhuǎn)移能夠增強小鼠的學習記憶能力，但ε4等位基因與β-AP具有異常結合的能力，容易導致β-AP沉積異常積聚，這樣反過來導致了AD的高發(fā)性。因此，APOE ε3基因可以作為AD的一種基因治療手段［40］。

體細胞基因打靶技術和核移植技術相結合的發(fā)展，為制作大中型動物人類疾病模型提供了很大的便利，目前已經(jīng)有基因敲除的豬［41］，雪貂［42］，羊［43］和兔［44］產(chǎn)生。而鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技術的出現(xiàn)促使基因組定點修飾技術向前邁進了一大步，使得基因敲除更為簡便［45-47］。其基本原理是利用鋅指結構域?qū)NA序列的特異性識別來達到準確定位靶點的目的，同時利用核酸酶的水解活性，使靶DNA雙鏈斷裂，然后利用細胞的修復機制，引入基因突變。通過這樣一對ZFNs一般可以切除一段10～200 bp的基因序列。ApoE基因敲除大鼠就是利用ZFN技術敲除了大鼠1號染色體第三個外顯子上的長度為16 bp的核酸，并通過近親雜交獲得純合子型。5～10周齡的ApoE基因敲除大鼠的血漿膽固醇水平與正常同齡野生型大鼠相比明顯升高，并且高脂飲食會使其壽命明顯縮短。但是，目前設計和篩選高效、高特異性的ZFNs仍然存在一些技術難題，而且降低ZFNs的細胞毒性也是一個相當大的技術挑戰(zhàn)。

之后出現(xiàn)的TALEN（TALE nucleases，TALENs）技術則克服了ZFNs技術的缺點。TALE（transcription activator-like effectors）是在植物病原體黃單胞菌（Xanthomonas）中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應因子，TALEN核酸酶是由TALEs DNA結合域和內(nèi)切核酸酶FokⅠ的切割域融合而成［48］。與ZFNs技術原理相似，TALEs的DNA結合域能夠識別特異的DNA序列，F(xiàn)okⅠ可通過二聚體產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性，在特異的靶DNA序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂。細胞在修復雙鏈斷裂的過程中，可產(chǎn)生各種類型的序列改變。理論上可以根據(jù)實驗目的對DNA結合域的重復序列進行設計，得到特異識別任意序列靶位點的TALEs，因而通過對TALEs重復序列進行人工設計并將其與一些功能域融合產(chǎn)生的dTALEs （designer TALE-type transcription factors）和TALENs引起了人們極大的興趣。另外，由于TALEN技術的操作簡單，沒有篩選過程，組裝完成后即可進行活性驗證，因此，該技術在酵母、動植物細胞的基因組定點修飾、遺傳疾病的基因療法及基因的功能研究等方面具有較為廣泛的應用前景。

2013年，一種全新的定向基因組編輯方法-CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated 9）逐漸得到越來越多學者的關注。CRISPR/Cas9主要是基于細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，它主要是通過序列特異的向?qū)NA介導的Cas蛋白對特定位點的DNA序列進行識別切割，形成雙鏈DNA斷裂（double strand break，DBS），然后借助同源重組機制（homology-directed repair，HDR）或者非同源末端連接機制（non-homologous end joining，NHEJ）對斷裂的DNA進行修復。同源重組一般通過供體DNA與基因組DNA之間的同源重組將靶位點進行糾正或者靶向插入外源基因。而非同源末端連接往往使得核酸鏈被破壞的區(qū)域發(fā)生基因突變，并導致編碼的基因功能喪失［49，50］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要特點是制作簡單、成本較低［51］，具有較高的靶向精確性，對于多種復雜程度不同的基因組擁有相應的甚至更高的活性，還可以同時針對同一細胞中的多個位點實現(xiàn)多靶點同時酶切［52］，并且同時運用兩對甚至更多對向?qū)NA可以明顯提高基因打靶效率，減少脫靶率［53］。目前，應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功制作出小鼠［14，49］，大鼠［54］，斑馬魚［55］，果蠅［56］，線蟲［57］，食蟹猴［58］，豬［59］，兔［60］等多種動物基因打靶模型。作者的研究小組也利用Cas9技術獲得了ApoE基因敲除兔（未發(fā)表文章）。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)為基因工程提供了一個強有力的應用新工具，為基因組定向編輯的研究和應用領域帶來突破性的進展。

5　總結

apoE蛋白在脂蛋白代謝中發(fā)揮著非常重要的作用，一旦缺失將會影響脂蛋白、脂溶性維生素和膽固醇從淋巴系統(tǒng)到血液中的轉(zhuǎn)運。越來越多的研究表明，APOE基因在人類中老年疾病中同樣起著非常重要的作用，在大規(guī)模人群的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，APOE基因的多態(tài)性和多種人類衰老性疾病的病程發(fā)展密切相關。目前，研究最多的是心血管疾病和AD，APOE基因的多態(tài)性可以作為診斷這些疾病的一個分子靶標，來參考疾病發(fā)生的可能性和發(fā)展的時間進程。研究APOE基因的正常生理功能及其與其他基因的關系，將有助于了解生命過程中基因和疾病的相關聯(lián)系。ApoE基因敲除小鼠和大鼠

的出現(xiàn)，使研究人類衰老性疾病具有了可評估的動物模型，它將有助于進一步深化研究ApoE基因的功能，同時，也為多種疾病的治療提供了藥物篩選的平臺。但是，小鼠的脂代謝過程和人類的脂代謝過程仍然存在一定的差異，主要表現(xiàn)在小鼠缺乏膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）活性，因此小鼠血漿脂蛋白主要是HDL，具有抗AS的作用，并且小鼠肝臟既能產(chǎn)生載脂蛋白B100，又可以合成載脂蛋白B48，含有B48的脂蛋白會被肝臟迅速清除，所以小鼠的血脂水平比人類低的多。相反，小型豬、家兔等大動物脂代謝過程與人類脂代謝過程更加接近，小型豬血漿脂蛋白的生化性質(zhì)、LDL結構以及載脂蛋白等與人類非常相似，而家兔體內(nèi)LDL含量高，血漿中富含CETP，可以自發(fā)誘導產(chǎn)生AS。因此研究開發(fā)更多ApoE基因敲除模型將有助于人類更加熟悉相關疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從而可以找到更為可靠有效的疾病治療方案。

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Advances on Research of APOE Gene Function and Related Diseases Models

JIANG Wei-hua，LI Shan-gang，CHEN Xue-jin
（Department of Laboratory Animal Sciences，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China）

Apolipoprotein E gene （APOE） is located on human chromosome 19，with 3.7 kb length. Its expression production is an alkaline protein containing arginine. ApoE can take part in lipid transport，storage and excretion，as well as nervous system development and injury repair process. High incidence of atherosclerosis and Alzheimer's disease occurred in human are related with lipid metabolism dysregulation. Researches on animals in vitro showed that the polymorphism of ApoE is related to coronary heart disease，hyperlipidemia and infarction. Transgenic and gene knock out or mutation animal models can help to know more about the process of lipid metabolism，understand the mechanism of occurrence and development process ，and find the potential therapeutic targets of related illnesses. Then more effective solutions for the treatment of human diseases can be provided. This essay briefly summaries the mechanism of some diseases related to APOE genotype and apoE protein，and also researches on the development of these diseases in vitro in animal models.

Apolipoprotein E （apoE）；Diseases models；Transgenic animals；Gene knockout

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0249-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.016

2014-07-15

國家自然基金面上項目（No.81170756/H0713），上海市科委（11140901600）

姜偉華（1988-），女，碩士研究生，專業(yè)方向: 發(fā)育生物學。E-mail: apple19880325@126.com

陳學進（1960-），男，研究員，博士生導師，研究方向:轉(zhuǎn)基因模式動物的制作。E-mail: chenxuej@aliyun.com