郭飛翔，陳大衛(wèi)，石雪晨，趙海晴，伍云，黃嘉棣，顧瑞霞，*（.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州57；.廣西皇氏甲天下乳業(yè)股份有限公司，廣西南寧530007）

分離的巴馬人群腸道乳酸菌數(shù)量及功能性分析

郭飛翔1，陳大衛(wèi)1，石雪晨1，趙海晴1，伍云2，黃嘉棣2，顧瑞霞1，*
（1.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127；2.廣西皇氏甲天下乳業(yè)股份有限公司，廣西南寧530007）

摘要：對(duì)采集的廣西巴馬地區(qū)長(zhǎng)壽家族糞便樣品進(jìn)行菌株分離，通過(guò)平板計(jì)數(shù)，比濁法和平板擴(kuò)散法對(duì)分離的乳酸菌菌群數(shù)量、耐受力和抑菌能力分析。結(jié)果表明：不同分離培養(yǎng)基之間的菌落總數(shù)有差異，并且桿菌選擇性培養(yǎng)基菌落數(shù)（108cfu/g～109cfu/g）要多于球菌選擇性培養(yǎng)基菌落數(shù)（107cfu/g～108cfu/g）；不同性別之間分離的女性腸道乳酸菌總數(shù)（8.98±0.42）（lg cfu/g）略高于男性（8.87±0.46）（lg cfu/g），不同年齡組中青少年組的腸道乳酸菌數(shù)量最多；分離的乳酸菌耐受能力比較發(fā)現(xiàn)中年組（0.408 5±0.082 7）（lg cfu/g）與老年組（0.372 6±0.083 2）（lg cfu/g）的耐受胃液能力相當(dāng)，且顯著大于青少年組（0.339 5±0.072 5）（lg cfu/g）和長(zhǎng)壽組（0.282 6±0.038 5）（lg cfu/g）；不同年齡組的耐膽鹽能力和耐受腸液能力相當(dāng)；分離的乳酸菌抑菌能力比較發(fā)現(xiàn)分離的不同年齡組的乳酸菌抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌能力都是青少年組最強(qiáng)，同一年齡組的乳酸菌抑制大腸桿菌能力較強(qiáng)；分離的男性腸道內(nèi)的乳酸菌抑制大腸桿菌能力要低于女性，但抑制金黃色葡萄球菌能力相當(dāng)。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)壽；腸道；乳酸菌；耐受性；抑菌

廣西巴馬是世界五大長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)中百歲老人分布率最高的地區(qū)，被譽(yù)為“世界長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)-中國(guó)人瑞圣地”。國(guó)際上公認(rèn)的長(zhǎng)壽因素[1-3]有4點(diǎn)：一是基因遺傳，二是生活環(huán)境，三是飲食習(xí)慣，四是社會(huì)背景。這4種因素的變化都能夠影響人類(lèi)腸道菌群的改變，而益生菌在腸道菌群均衡中起著重要的作用[4]，它們能夠提高腸道對(duì)病原菌的抵抗能力，同時(shí)預(yù)防及早期治療一些由特定病原菌感染引起的疾病，促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[5]。也有研究表明乳酸菌具有降低膽固醇[6]，輔助治療肝病[7]，補(bǔ)充微量元素[8-9]，抗氧化[10-11]等功能。本文通過(guò)分離巴馬人群腸道乳酸菌及對(duì)其數(shù)量和耐受性、抑菌能力進(jìn)行分析，旨在建立長(zhǎng)壽人群腸道乳酸菌菌種庫(kù)，并篩選出一批耐受能力及抑菌能力較強(qiáng)的乳酸菌，為食品、藥品等行業(yè)提供優(yōu)良菌種；并且比較分析分離的長(zhǎng)壽人群腸道菌群數(shù)量、乳酸菌耐受性和抑菌能力。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

運(yùn)輸培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司；碳酸氫鈉，結(jié)晶紫，碘片，硫酸鎂等：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；魚(yú)粉蛋白胨，石蠟，氫氧化鈉，無(wú)水乙醇，氯化鈣，酵母提取物，葡萄糖，吐溫-80，胰胨，番紅，甘油等：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸新霉素，X-Gal，萘啶酸，氯化鋰等：購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Bugbox型厭氧工作站：英國(guó)Ruskinn公司；H2500R-2型高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SX-500型高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；YJ-8755型醫(yī)用超潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；Freezon-18L型冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Labconco公司；BC/BD-216SCN海爾冰柜：青島海爾集團(tuán)；可調(diào)式封閉電爐：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；1510型酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司。

1.3培養(yǎng)基的制備及溶液的配制

1.3.1培養(yǎng)基

1）MC培養(yǎng)基[12]：大豆蛋白胨5 g，牛肉浸膏5 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，乳糖20 g，碳酸鈣10 g，中性紅0.01 g，番茄汁200 mL，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH至6.0，121℃滅菌15 min，冷卻備用；

2）PTYG培養(yǎng)基：胰胨5 g，大豆蛋白胨5 g，多聚蛋白胨3 g，酵母膏10 g，葡萄糖10 g，吐溫-80 1 mL，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，鹽溶液40 mL（鹽溶液制備：CaCl20.2 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.48 g，NaHCO310 g，NaCl 2 g，蒸餾水1 000 mL，溶解后備用），蒸餾水加至1000mL，調(diào)pH至6.8～7.0，121℃滅菌15 min，冷卻備用；

3）LCM培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，胰蛋白3 g，葡萄糖20 g，檸檬酸鈉2 g，鹽溶液5 mL（鹽溶液制備：MgSO4·7H2O 11.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.68 g，MnSO4·2H2O 2.4 g，蒸餾水加至100 mL），K2HPO43 g，KH2PO43 g，半胱氨酸0.20 g，乙酸鈉1 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水加至1 000 mL，調(diào)pH至6.8，121℃滅菌15 min，冷卻備用；

4）MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸出汁5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4· 4H2O 0.25 g，碳酸鈣20 g，蒸餾水加至1 000 mL，調(diào)pH 至5.6，121℃滅菌15 min，冷卻備用；

5）TYC培養(yǎng)基：胰胨15 g，酵母膏5 g，L-胱氨酸0.2 g，乙酸鈉20 g，Na2SO40.1 g，NaCl 1 g，Na2HPO4· 12H2O2g，NaHCO32g，蔗糖50g，蒸餾水加至1000mL，調(diào)pH至7.3，121℃滅菌15 min，冷卻備用；

6）M17培養(yǎng)基：植物蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，聚蛋白胨5 g，抗壞血酸0.5 g，牛肉浸膏2.5 g，1.0 mol/L MgSO4·7H2O 1.0 mL，β-甘油磷酸二鈉19 g，蒸餾水加至1000mL，調(diào)pH至7.1，121℃滅菌15min，冷卻備用；

7）SL培養(yǎng)基：酪蛋白水解物10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，K2HPO46 g，乙酸鈉（3H2O）25 g，檸檬酸二銨2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4· 4H2O 0.15 g，吐溫80 1.0 mL，蒸餾水加至1 000 mL，調(diào)pH至5.4，121℃滅菌15 min，冷卻備用；

8）LB培養(yǎng)基：950.0 mL水加胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出汁5.0 g，氯化鈉10.0 g，加熱攪拌均勻溶解后，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH（7.2±0.2）后，補(bǔ)水至1 000 mL，配制固體培養(yǎng)基則在調(diào)pH后加入1.5%瓊脂，121℃、15 min滅菌備用。

1.3.2人工胃液的配制

量取1 mol/L的鹽酸20 mL，加蒸餾水調(diào)節(jié)pH值至3.0，加入NaCl使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.2%，然后每100 mL加入1 g胃蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.22 μm微孔濾膜在無(wú)菌操作臺(tái)中過(guò)濾除菌，轉(zhuǎn)入滅菌過(guò)的瓶中低溫保藏備用[13]。

1.3.3人工腸液的配制

稱(chēng)取KH2PO43.4g，加蒸餾水250mL溶解，用0.4% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，加水稀釋至500 mL，加入NaCl使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.2%，每100 mL加入1 g胰蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.22 μm微孔濾膜在無(wú)菌操作臺(tái)中過(guò)濾除菌，轉(zhuǎn)入滅菌過(guò)的瓶中低溫保藏備用[13]。

1.4樣品的采集

樣品采集新鮮、一星期內(nèi)未服用抗生素的長(zhǎng)壽村人群的黃軟大便，用竹簽挑取糞便內(nèi)部中心糞便樣品放入運(yùn)輸培養(yǎng)基中，再加入5 mL滅菌液體石蠟油密封后，迅速置于冰盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物菌群分析；采樣同時(shí)對(duì)長(zhǎng)壽村人群的飲食習(xí)慣進(jìn)行調(diào)查。經(jīng)統(tǒng)計(jì)樣品來(lái)源中男性23人（1歲～95歲），女性23人（3歲～100歲），采樣人群的分布情況如表1所示。

1.5乳酸菌的分離與計(jì)數(shù)

將帶回的樣品在無(wú)菌操作臺(tái)上用無(wú)菌水稀釋至相應(yīng)稀釋度后從試管中取1 mL稀釋液，分別接種于滅菌的平板中，倒入先前配好的選擇性培養(yǎng)基MRS、PTYG、SL、LCM、TYC、M17、MC放入?yún)捬豕ぷ髡局?7℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)平板上的活菌數(shù)和稀釋度，選取菌落數(shù)在30 cfu/g～300 cfu/g之間的平板計(jì)算出活菌數(shù)。

1.6乳酸菌的初步鑒定

對(duì)分離到的乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，并進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性及產(chǎn)氣、過(guò)氧化氫酶、產(chǎn)酸等生理生化鑒定[12]。

1.7乳酸菌耐膽鹽能力的測(cè)定

將活化兩代的菌種按5%接種量接種到富含0.5%牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h，分別測(cè)定培養(yǎng)0、4 h培養(yǎng)基OD620nm值[14]，以未接種乳酸菌的富含牛膽鹽的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，按下面公式計(jì)算：

1.8乳酸菌對(duì)人工胃液耐受能力的測(cè)定

將活化兩代的菌種按5%接種量接種到pH為3的人工胃液中，37℃培養(yǎng)4 h，分別測(cè)定培養(yǎng)0、4 h人工胃液OD620nm值[15-16]，以未接種乳酸菌的人工胃液為空白對(duì)照，按下面公式計(jì)算：

1.9乳酸菌對(duì)人工腸液耐受能力的測(cè)定

將活化兩代的菌種按5%接種量接種到人工腸液中，37℃培養(yǎng)4 h，分別測(cè)定培養(yǎng)0、4 h人工腸液OD620nm值[17]，以未接種乳酸菌的人工腸液為空白對(duì)照，按下面公式計(jì)算：

1.10乳酸菌對(duì)致病菌的抑制作用

將LB培養(yǎng)基倒入平板中，冷凝后加入0.1 mL菌液濃度為108cfu/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，涂抹均勻放置1 h后打孔，孔徑10 mm，孔深3 mm，將乳酸菌發(fā)酵液注入孔內(nèi)，于37℃倒置培養(yǎng)10 h后測(cè)量抑菌圈大小[18-19]。

1.11數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1腸道乳酸菌的分離及分析

用6種培養(yǎng)基對(duì)46份糞便樣品進(jìn)行菌株分離并計(jì)數(shù)，共分離獲得2076株菌株，經(jīng)生理生化鑒定將1823株菌株初步確定為乳酸菌；不同分離培養(yǎng)基平均菌落總數(shù)見(jiàn)圖1。

由圖1可知，同一人群不同培養(yǎng)基來(lái)源之間的菌落總數(shù)存在顯著性差異，其中PTYG為雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基，其菌落總數(shù)在109cfu/g左右，而雙岐桿菌是健康人體的優(yōu)勢(shì)菌群，數(shù)量一般在109cfu/g以上，但由于糞便樣品脫離腸道，暴露于空氣中后部分失活，所以最終計(jì)數(shù)結(jié)果在109cfu/g左右；SL、LCM為乳桿菌選擇性培養(yǎng)基，其菌落總數(shù)在108cfu/g～109cfu/g；TYC、M17為腸球菌選擇性培養(yǎng)基，其菌落總數(shù)在107cfu/g～108cfu/g；而MRS培養(yǎng)基并沒(méi)有較強(qiáng)的選擇性，桿菌球菌能夠生長(zhǎng)，所以其菌落總數(shù)在109cfu/g以上。這說(shuō)明分離的健康人群體內(nèi)的桿菌數(shù)要比球菌數(shù)要多，桿菌中尤其是雙岐桿菌對(duì)人類(lèi)健康有著非常重要的作用[20]。

2.2分離的不同人群腸道乳酸菌總數(shù)的比較

通過(guò)對(duì)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基MC平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，分離的人群中女性腸道乳酸菌總數(shù)略高于男性，但是差異性不顯著；青少年組的腸道乳酸菌數(shù)量最多，隨著年齡的增長(zhǎng)，乳酸菌數(shù)量逐漸減少，但是長(zhǎng)壽組乳酸菌數(shù)量還是保持著一個(gè)很高的水平，與中年組及青年組水平相當(dāng)，說(shuō)明長(zhǎng)壽老人仍保持著一個(gè)健康的腸道菌群平衡。

2.3分離的腸道乳酸菌的耐受能力的比較

通過(guò)比色法對(duì)分離的菌株進(jìn)行耐受性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，中年組與老年組的菌株耐受胃液能力相當(dāng)，且顯著大于青少年組和長(zhǎng)壽組，其中長(zhǎng)壽組菌株耐受胃液能力最差；不同年齡各組的菌株耐膽鹽能力和耐受腸液能力相當(dāng)，并無(wú)顯著性差異；不同性別組的菌株耐受能力都無(wú)顯著性差異；對(duì)菌株不同的耐受能力的參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)分離的乳酸菌對(duì)胃液耐受能力顯著高于對(duì)膽鹽和腸液的耐受能力。

2.4分離的不同年齡人群腸道乳酸菌對(duì)致病菌的抑制作用

通過(guò)單層瓊脂平板擴(kuò)散法，探討了分離菌株對(duì)致病菌的抑制能力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，分離的不同年齡組的乳酸菌抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌能力都是青少年組>中年組>長(zhǎng)壽組>老年組，其中中年組要顯著強(qiáng)于老年組；分離的同一組別的乳酸菌抑制大腸桿菌能力要強(qiáng)于抑制金黃色葡萄球菌能力；分離的男性腸道內(nèi)的乳酸菌抑制大腸桿菌能力要低于女性，但抑制金黃色葡萄球菌能力相當(dāng)。

3　結(jié)論與討論

1）通過(guò)對(duì)巴馬人群飲食調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其飲食結(jié)構(gòu)是低能量、低脂肪、低鹽、低膽固醇飲食。人們每天早晚喜歡喝粥，中午吃米飯和玉米，不酗酒；他們喜歡食用天然、綠色食品如吃的是青菜、果菜、野菜以及巴馬當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的火麻仁，其中火麻仁富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、卵磷脂、油酸、亞麻酸等，是唯一能溶于水的植物油，還含有人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分。而且，這些菜大都是煮著吃，很少炒；喝的是純天然的山泉水，水質(zhì)好。

2）通過(guò)對(duì)分離的巴馬人群不同培養(yǎng)基來(lái)源的乳酸菌菌群數(shù)量比較，發(fā)現(xiàn)分離的桿菌數(shù)要多于球菌數(shù)，女性腸道乳酸菌總數(shù)略高于男性，青少年組的腸道乳酸菌數(shù)量最多，隨著年齡的增長(zhǎng)，乳酸菌數(shù)量逐漸減少，但是長(zhǎng)壽組乳酸菌數(shù)量還是保持著一個(gè)很高的水平；對(duì)其耐受能力比較發(fā)現(xiàn)它們的耐受能力都不是很高，可能是由于體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)有較大的差異，在腸道中有很多微生物共生，而且厭氧，而由于條件的限制無(wú)法完全做到；乳酸菌對(duì)胃液耐受能力高于對(duì)膽鹽和腸液的耐受能力，可能是因?yàn)楸旧泶x可產(chǎn)生大量乳酸，因而對(duì)酸不敏感；對(duì)其抑制致病菌能力比較發(fā)現(xiàn)抑菌能力隨著年齡增長(zhǎng)逐漸減弱，但是長(zhǎng)壽老

人體內(nèi)乳酸菌抑菌能力仍比較強(qiáng)，分離的男性腸道內(nèi)的乳酸菌抑制大腸桿菌能力要低于女性，但抑制金黃色葡萄球菌能力相當(dāng)。

3）由于試驗(yàn)的菌株數(shù)較多，只能對(duì)運(yùn)用比色法對(duì)其耐受能力進(jìn)行初步測(cè)定，想要篩選出大量的優(yōu)良菌種還需用平板計(jì)數(shù)法對(duì)其耐受、抑菌能力以及其他功能特性進(jìn)一步研究。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.043

收稿日期：2014-07-15

基金項(xiàng)目：江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD18B12）；江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2011383）；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（12KJA550003）

作者簡(jiǎn)介：郭飛翔（1990—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：乳品科學(xué)。

*通信作者：顧瑞霞（1963—），男（漢），教授，博士，研究方向：乳品科學(xué)。

Analyze the Amount of Lactic Acid Bacteria from Population of Bama and Their Function

GUO Fei-xiang1，CHEN Da-wei1，SHI Xue-chen1，ZHAO Hai-qing1，WU Yun2，HUANG Jia-di2，GU Rui-xia1，*
（1.Jiangsu Province Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2.Guangxi Huangshi Jiatianxia Dairy Co.，Ltd.，Nanning 530007，Guangxi，China）

Abstract：Collect the stool specimens from longevity village population of Bama for separating strain and analyzing the amount of them and capacity of tolerance and inhibition by plate colony-counting，turbidimetry，plate diffusion.The results showed that：the amount of colony between different isolation medium had difference，and the amount of bacillus（108cfu/g-109cfu/g）was more than coccus（107cfu/g-108cfu/g）；the amount of colony from female（8.98±0.42）（lg cfu/g）was more than male（8.87±0.46）（lg cfu/g），youth group had was the most among age groups；the capacity of tolerating gastric juice of middle age group（0.408 5±0.082 7）（lg cfu/g）and old age group（0.372 6±0.083 2）（lg cfu/g）were similar，and theirs were significantly higher than youth（0.339 5±0.072 5）（lg cfu/g）and longevity group（0.282 6±0.038 5）（lg cfu/g）；capacity of tolerating bile and intestinal juice between age groups had no significant difference；the youth group had the strongest inhibitory effect on E.coil and Staphylococcus aureus among age groups，and the strains had stronger inhibitory effect on E.coil than Staphylococcus aureus；the strain from male had lower inhibitory effect on E.coil than female，but had no significant difference on Staphylococcus aureus.

Key words：longevity；intestinal；lactic acid bacteria；capacity of tolerance；inhibition