呂凱波，吳士筠，張晟（武漢工商學(xué)院，湖北武漢430065）

雙水相體系萃取啤酒酵母中乙醇脫氫酶工藝

呂凱波，吳士筠*，張晟
（武漢工商學(xué)院，湖北武漢430065）

摘要：研究構(gòu)建聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對乙醇脫氫酶（ADH）進(jìn)行提取。探討了PEG分子量、PEG濃度、（NH4）2SO4濃度、粗酶添加量對ADH純化倍數(shù)的影響。結(jié)果表明，在（NH4）2SO4濃度為18%、PEG800濃度為22%、粗酶添加量為5%所組成的雙水相體系下，ADH的純化倍數(shù)可達(dá)3.815。

關(guān)鍵詞：ADH；PEG/（NH4）2SO4；雙水相萃取

乙醇脫氫酶（ADH）屬氧化還原酶第一亞類，是以NAD+、NADP+或PQQ為輔酶，作用于-CHOH基團(tuán)，催化伯醇和醛之間可逆反應(yīng)的一種含鋅金屬酶[1-3]。由于ADH為胞內(nèi)酶，故市場上ADH多來源于動(dòng)物肝臟，雖提取純化工藝較成熟，但是動(dòng)物肝臟資源較少，且價(jià)格昂貴不易保存，產(chǎn)品遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求。啤酒廠廢棄啤酒酵母中含有大量的ADH，收集廢棄酵母進(jìn)行酶的提取，可以減少資源的浪費(fèi)，變廢為寶[4]。

本研究構(gòu)建了聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對廢棄啤酒酵母中ADH進(jìn)行萃取分離，探討了PEG分子量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗酶添加量對ADH純化倍數(shù)的影響，為工業(yè)化提取生產(chǎn)ADH提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

啤酒酵母泥：由武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)分中心提供。

輔酶Ⅰ（NAD+）、牛血清白蛋白BSA：廈門星隆達(dá)試 劑 公司 ；PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000、考馬斯亮藍(lán)G-250、固體硫酸銨[（NH4）2SO4]：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

GL-21M高速冷凍離心機(jī)：長沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司；TY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎儀：上海比朗儀器有限公司；SPX-150-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722E型可見分光光度計(jì)、752型紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；JM-A2002電子天平：諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1酵母菌制備

10%豆芽汁培養(yǎng)基制備：參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行配置。

酵母菌制備：將廢棄啤酒酵母接種于培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接至相同成分培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)48 h到對數(shù)期，取發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min離心15 min，收集菌體，用蒸餾水沖洗2次得到酵母菌。

1.2.2粗酶液制備[6]

采用玻璃珠聯(lián)合超聲波破碎法破壁處理，10 000 r/ min冷凍離心10 min，得到上清液即為乙醇脫氫酶（ADH）粗酶液。

1.2.3PEG/（NH4）2SO4雙水相體系的建立[7]

根據(jù)體系總質(zhì)量及加入的（NH4）2SO4、PEG質(zhì)量，計(jì)算出（NH4）2SO4和PEG在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分濃度（g/g）。

1.2.4雙水相萃取操作方法[8]

測定相比R、上下相中的酶活力及蛋白質(zhì)含量。

1.2.5蛋白質(zhì)測定[9]

采用馬斯亮蘭G-250法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.6ADH酶活力的測定[10]

定義每分鐘A340增加0.001為1活力單位（U）。

1.3純化倍數(shù)的計(jì)算[11]

以ADH純化倍數(shù)來探究雙水相最佳提純條件，ADH提取相（下相）中的純化倍數(shù)計(jì)算公式：

式中：Et是ADH提取相活性單位，units/mL；Pt是ADH提取相總蛋白質(zhì)濃度單位，μg/mL；Ei是ADH粗酶液活性單位，units/mL；Pi是原酶液總蛋白質(zhì)濃度單位，μg/mL。

2　試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按1.2.5的試驗(yàn)方法繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of BSA

由圖1可知，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.061x+0.106，R2=0.998 6。蛋白濃度在20 μg/mL～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2雙水相體系成相物質(zhì)對ADH酶活力的影響

2.2.1不同分子量PEG對ADH酶活力的影響

配制質(zhì)量濃度為 20%的 PEG400、PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000溶液。吸取5 mL PEG溶液放入試管中，加入0.5 mL粗酶液混勻，靜置10 min后測定酶活力，計(jì)算PEG溶液中酶活力和粗酶液酶活力之比，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　PEG分子量對ADH酶活力的影響Fig.2　The influence of PEG molecular weight on the ADH enzyme activity

由圖2可知，ADH活性基本與粗酶液酶活力相近，在PEG2000加入時(shí)甚至高于粗酶液，說明不同分子量PEG對ADH酶活力影響不明顯[12]。

2.2.2不同濃度（NH4）2SO4對ADH酶活力的影響

配制濃度梯度為15%、20%、25%、30%、35%、40%的（NH4）2SO4溶液，吸取5 mL（NH4）2SO4溶液放入試管中，加入0.5 mL粗酶液混勻，靜置10 min后測定酶活力，計(jì)算（NH4）2SO4中溶液酶活力和粗酶液酶活力之比，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　（NH4）2SO4濃度對ADH酶活力的影響Fig.3　The influence of（NH4）2SO4concentrations on the ADH enzyme activity

由圖3所示，隨（NH4）2SO4濃度增加，溶液中的ADH活性下降，這是由于（NH4）2SO4的鹽析作用使ADH被（NH4）2SO4沉淀。（NH4）2SO4濃度在15%～25%之間是對ADH酶活力影響不大。

2.3雙水相體系萃取ADH最佳條件確定

2.3.1雙水相體系中最佳PEG分子量確定

按1.2.3方法建立（NH4）2SO4濃度為20%，PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000溶度均為20%雙水相體系，粗酶添加量為5%。按1.2.4方法進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算純化倍數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

圖4　不同分子量的PEG對純化倍數(shù)的影響Fig.4　The influence of PEG molecular weight on the purification multiples

由圖4可知，當(dāng)PEG分子量為800時(shí)，酶純化倍數(shù)最高3.563。由于下相蛋白質(zhì)含量低酶活力高，可見ADH主要分配在下相中。故雙水相萃取提取ADH時(shí)，使之盡可能分配在下相，選擇PEG800作為成相組分。

2.3.2雙水相體系中最佳PEG濃度確定

按1.2.3方法建立（NH4）2SO4濃度為20%，PEG800濃度分別為14%、16%、18%、20%、22%、24%雙水相體系，粗酶添加量為5%。按1.2.4進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5　PEG800的濃度對純化倍數(shù)的影響Fig.5　The influence of PEG800 concentration on purification multiples

由圖5可知，在14%～22%范圍內(nèi)，純化倍數(shù)隨PEG800濃度增加而升高，當(dāng)PEG800濃度為22%時(shí)，純化倍數(shù)最高4.113。當(dāng)PEG800濃度提高到24%時(shí)，下相當(dāng)中蛋白質(zhì)濃度高，且酶活力迅速降低，導(dǎo)致純化倍數(shù)降低，故選擇PEG800濃度為22%為最佳。

2.3.3雙水相體系中最佳（NH4）2SO4濃度確定

按1.2.3方法建立PEG800濃度為22%，（NH4）2SO4濃度為12%、14%、16%、18%、22%，粗酶添加量為5%的雙水相體系，按1.2.4方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6?。∟H4）2SO4濃度對純化倍數(shù)的影響Fig.6　The influence of（NH4）2SO4concentrations on purification multiples

由圖6可知，當(dāng)（NH4）2SO4濃度逐漸升高時(shí)，ADH純化倍數(shù)先增大后減小。當(dāng)濃度為18%時(shí)，酶的純化倍數(shù)達(dá)到最大值4.602。這是由于隨著（NH4）2SO4濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，無機(jī)鹽的鹽析作用加強(qiáng)，ADH更趨向分配于上相，下相蛋白質(zhì)濃度降低[13]。故選取雙水相體系中（NH4）2SO4最佳濃度為18%。

2.3.4最適粗酶加入量確定

按1.2.3方法建立PEG800濃度為22%，（NH4）2SO4濃度為18%，粗酶添加量為1%、3%、5%、7%、9%的雙水相體系，按1.2.4方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。

圖7　粗酶添加量對純化倍數(shù)的影響Fig.7　The influence of crude enzyme additives on purification of multiples

由圖7可知，隨著粗酶添加量的增加，酶的純化倍數(shù)先增大后減小。當(dāng)粗酶添加量為5%時(shí)，酶純化倍數(shù)最高達(dá)到3.857，故選取粗酶添加量為5%為最適添加量。

2.3.5驗(yàn)證試驗(yàn)

建立PEG800濃度為22%、（NH4）2SO4濃度為18%、粗酶添加量為5%的雙水相體系，固定雙水相體系質(zhì)量為20 g，搖勻，靜置2 h后測量純化系數(shù)。3次試驗(yàn)結(jié)果為3.634、3.708、4.102，平均值為3.815，表明萃取的條件優(yōu)化是有效的。

3　結(jié)論

本研究采用PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)對ADH進(jìn)行萃取分離，探究了成相組分對酶活力的影響，確定雙水相最佳萃取體系，并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)雙水相萃取過程中上相（PEG）基本無酶活力，但蛋白質(zhì)濃度較高，而下相（（NH4）2SO4溶液）中蛋白質(zhì)濃度低，酶活力較高，結(jié)果表明：PEG分子量為800、PEG濃度為22%、（NH4）2SO4濃度為18%、粗酶添加量為5%時(shí)雙水相體系的ADH純化倍數(shù)較高，多次為試驗(yàn)平均純化倍數(shù)為3.815。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.017

收稿日期：2015-10-26

作者簡介：呂凱波（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品加工及貯藏。

*通信作者：吳士筠（1950—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，學(xué)士，研究方向：生物化學(xué)。

The Technology of Alcohol Dehydrogenase Extraction from Beer Yeast by Aqueous Two-phase Systems

Lü Kai-bo，WU Shi-jun*，ZHANG Sheng
（Wuhan Technology and Business University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Abstract：This study build polyethylene glycol（PEG）/ammonium sulfate[（NH4）2SO4]two water phase systemextraction on ADH.The influences of PEG molecular weight，PEG concentration，（NH4）2SO4concentration and crude enzyme additives on purification multiples were further investigated.The results showed that the purification multiples of ADH was 3.815 when the aqueous two-phase system were 18%（NH4）2SO4，22.0% PEG800 and 5%crude enzyme additives.

Key words：ADH；PEG/（NH4）2SO4；the aqueous two-phase system extraction