(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東 菏澤 274015)

響應(yīng)面法優(yōu)化三七花多酚的提取工藝及其抗氧化性分析

朱素英

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東 菏澤 274015)

目的:探究三七花多酚的提取優(yōu)化工藝以及其抗氧化性。方法:利用單因素試驗，選擇提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)3 個因素，采用響應(yīng)面的中心組合試驗設(shè)計，得到三因素及其交互作用對三七花多酚提取量影響的多元回歸方程、響應(yīng)面圖及三七花多酚提取量與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除能力的相關(guān)性。結(jié)果:三七花多酚提取的最佳條件為提取溫度75 ℃、提取時間47 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，多酚提取量（以沒食子酸當(dāng)量計）預(yù)測值可達58.95 mg/g，且實際值為預(yù)測值的98.44%，抗氧化性與三七花多酚提取量的相關(guān)系數(shù)為0.757 208。結(jié)論:最佳條件下實際值與預(yù)測值相符，說明預(yù)測結(jié)果可靠，可作為三七花多酚提取的優(yōu)化條件；三七花多酚提取量與DPPH自由基清除率高的相關(guān)性說明三七花多酚具有較強的抗氧化性。

三七花；多酚；響應(yīng)面；提取工藝；抗氧化

三七花為名貴傳統(tǒng)中藥三七（Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen）的花蕾，三七花與根均可藥食兩用。三七花性甘涼，具有活血化瘀、抗炎、抗癌、降血壓血脂、護肝等作用[1-4]，同時三七花也作為保健品應(yīng)用于食品、家庭烹飪等[5]。目前從三七花中獲得的有效成分主要為皂苷類[6-7]，另外還有些揮發(fā)油類[8]、多糖類等[9]成分。酚類物質(zhì)在三七花中還未見報道，多酚類物質(zhì)具有較強的抗自由基[10]、抗氧化性[11-15]、抗腫瘤[15-16]以及預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的能力[17-18]，筆者實驗研究表明三七花亦含有豐富的多酚成分，本實驗利用響應(yīng)面法對三七花多酚進行提取優(yōu)化，并對三七花提取液多酚提取量與清除DPPH自由基能力相關(guān)性抗氧化性進行探討，為三七花進一步加工利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七花購于云南文山，經(jīng)菏澤學(xué)院植物學(xué)教研室周長路副教授鑒定為五加科人參屬三七的干燥花蕾。

Folin-Ciocalteu試劑 上海荔達有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；沒食子酸、碳酸鈉、乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊實業(yè)公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；FW-100型高速萬能粉碎機 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 三七花前處理及提取

將三七干花蕾粉碎機粉碎后過40 目篩,置于真空干燥箱60 ℃干燥至質(zhì)量恒定,分別稱取2 g按照液料比15∶1 (mL/g)置于三角燒瓶中,按照實驗設(shè)計條件于水浴鍋中進行浸提,過濾,重復(fù)2 次后合并3 次提取液,定容至50 mL,于4 ℃保存,以備后用。

1.3.2 三七花多酚提取量的測定

采用Folin-Ciocalteu法[19]:移液槍移取提取液0.5 mL，加入5 mL的稀釋10 倍Folin-Ciocalteu試劑，搖勻后，靜置反應(yīng)5 min，再加入7.5%的Na2CO3溶液4 mL，加入1.5 mL蒸餾水至反應(yīng)體系為11 mL，搖勻，室溫放置60 min，在波長765 nm處測定吸光度。采用沒食子酸為對照品，獲得沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出三七花提取液多酚的質(zhì)量濃度，以沒食子酸當(dāng)量表示，根據(jù)以式（1）算出三七花多酚提取量（Y）。

式中:ρ為提取液多酚質(zhì)量濃度（以沒食子酸當(dāng)量計）/（mg/mL）；V為提取液定容后體積/mL；m為三七花粉末干質(zhì)量/g。

1.3.3 抗氧化性測定

選用DPPH自由基清除法[20]，取0.5 mL樣品，加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液和2.5 mL的無水乙醇，混勻，暗處靜置30 min，517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率（S）可以用式（2）計算:

式中:Ac為3 mL無水乙醇與3 mL DPPH溶液的吸光度；As為0.5 mL提取液與2.5 mL無水乙醇與3 mL DPPH溶液的吸光度。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

選取影響多酚的提取條件有液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)4 個變量，研究變量對三七花多酚提取的影響，選擇合適的變量范圍。單因素變量設(shè)計如表1所示，當(dāng)其中一項作為變量時，選取其他提取條件作為固定提取條件，固定提取條件:液料比20∶1、提取時間40 min、提取溫度60 ℃、80%乙醇溶液。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)3 個變量，利用Design-Expert軟件進行響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

進行響應(yīng)面設(shè)計之前要進行相關(guān)單因素的范圍的確定，本著安全經(jīng)濟的原則，選用一定比例的乙醇作為提取劑。考察液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)4 個單因素對三七花多酚提取的影響。

如圖1A所示，三七花多酚提取量隨著液料比增加而增加，液料比20∶1時多酚提取量趨于平穩(wěn)，液料比20∶1、40∶1、80∶1多酚提取量無顯著差異（P＞0.05），液料比5∶1、10∶1三七花粉末不能完全溶解，從液料比20∶1開始，三七花多酚基本溶出完全，增大液料比不能增加多酚提取量，且液料比越大，會增加多酚濃縮所用時間，增大多酚被氧化的幾率[21]。因此20∶1可作為進一步試驗的最佳液料比。

如圖1B所示，隨著提取時間從10 min延長至40 min，多酚提取量逐漸增加，提取時間達到40 min時多酚提取量達到55.312 mg/g，提取時間繼續(xù)延長多酚提取量差異不顯著（P＞0.05），且延長提取時間會使多酚提取量稍有降低[22]，很可能延長提取時間使多酚降解，同時使一些蛋白質(zhì)、多糖的等成分溶出[23]。因此選擇25、40、55 min作為響應(yīng)面設(shè)計的低點、中點、高點。

如圖1C所示,提取溫度對三七花多酚提取量影響顯著,在提取溫度較低時,15～60 ℃三七多酚提取量隨著提取溫度的升高逐漸增加,60 ℃時達到最大值,超過60 ℃,75～90 ℃多酚提取量略有降低。溫度升高增大多酚的溶解度和擴散系數(shù)，可以提高多酚提取量[24]，但由于有些酚類，特別是類黃酮類為熱敏性，當(dāng)溫度過高時，會造成降解。

由圖1D可以看出，用水提取多酚提取量高于100%乙醇，水醇混合物可以提高多酚的得率，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%～60%時，多酚提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加逐漸增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%多酚提取量達到最大56.74 mg/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時多酚提取量下降，100%時下降至低于水提取物。因此選擇40%、60%、80%作為響應(yīng)面設(shè)計的乙醇體積分?jǐn)?shù)的低點、中點和高點。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)中心組合試驗設(shè)計步驟進行多酚的提取以及提取液DPPH自由基清除能力測定，結(jié)果見表2，試驗結(jié)果利用Design-Expert進行分析。

2.3 三七花多酚提取工藝優(yōu)化

根據(jù)中心組合試驗結(jié)果，進行回歸分析，得多元二次回歸方程:

Y=16.617 96+0.023 389A+1.062 81B+0.637 56C+ 0.003 197 69AB-0.000 886 630AC+0.002 427 49BC-0.000 397 771A2-0.015 163B2-0.007 238 02C2

根據(jù)表3統(tǒng)計結(jié)果可以看出，該模型在P＜0.01水平上極顯著，失擬項0.142 0不顯著（P＞0.05），說明該模型可以用于三七花多酚提取的優(yōu)化分析，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 5，校正系數(shù)為0.987 5，說明該模型擬合度較高，可以用于預(yù)測三七花多酚的優(yōu)化。因素A、B、C、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），AB、BC影響顯著（P＜0.05）。AC、A2不顯著，剔除不顯著相，多元回歸方程優(yōu)化為:

Y=21.553 39-0.077 541A+1.053 40B+0.576 43C+ 0.003 197 69AB+0.002 427 49BC-0.015 046B2-0.007 171 92C2

響應(yīng)面圖等高線越扁則說明兩因素的交互作用對提取得率影響越大,響應(yīng)面呈峰形,有極大值。綜合圖2與表3,C對多酚提取影響最大,其次是B2、B、C2、A,在P＜0.01水平上均達到極顯著。交互效應(yīng)對多酚提取的影響B(tài)C＞AB,影響顯著(P＜0.05),各因素對三七花多酚影響從大到小依次為：C＞B2＞B＞C2＞A＞BC＞AB＞AC＞A2。

利用Design-Expert軟件對多元二次方程模型進行提取條件優(yōu)化，三七花多酚的提取優(yōu)化最佳條件為提取溫度75 ℃、提取時間46.85 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)48.11%，多酚提取量為59.90 mg/g。

在實驗室條件下，為了便于操作，優(yōu)化條件修改為提取溫度75 ℃、提取時間47 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，在液料比20∶1的條件下進行驗證實驗，多酚提取量可達58.95 mg/g，為預(yù)測值的98.44%，與預(yù)測值符合度較高，因此此實驗條件可以用于三七花多酚提取的優(yōu)化。

2.4 多酚提取量與其DPPH自由基清除能力的關(guān)系

表2中中心組合試驗設(shè)計條件下,DPPH自由基的清除能力最大可達74.99%,結(jié)合表2分析多酚提取量與DPPH自由基清除率相互關(guān)系,如圖3所示,在P＞0.01水平上,三七花多酚提取量與DPPH自由基清除能力大小相關(guān)性顯著,且相關(guān)系數(shù)達到r值為0.757 208,說明三七花多酚在抗氧化中起到重要作用。

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化了三七花多酚的提取工藝，建立其多元二次優(yōu)化模型，并對三七花多酚提取量與DPPH自由基清除率之間的關(guān)系進行研究，結(jié)果顯示乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量影響最大，三七多酚提取的最佳條件為在溫度75 ℃水浴中提取47 min、提取溶劑為48%乙醇溶液，多酚提取量為58.95 mg/g，實際值與預(yù)測值相符。因此利用響應(yīng)面法對三七花多酚進行提取和優(yōu)化可行，且提取條件簡便，節(jié)能有效。另外根據(jù)目前的文獻可知，三七花多酚的含量要高于三七根[25]，很可能是三七花中含有較多花青素的緣故。三七花多酚提取量與三七花提取液DPPH自由基清除能力較高的相關(guān)性，表明三七花水醇提取液多酚具有較強的抗氧化性。

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Optimization of Extraction Process for Polyphenolics from Panax notoginseng Flowers by Response Surface Methodology and Its Antioxidant Activity

ZHU Suying
(Department of Life Science, Heze University, Heze 274015, China)

Objective: To optimize the extraction of polyphenol from Panax notoginseng flowers and examine its antioxidant activity. Methods: Ethanol concentration, and extraction temperature and time were identified as main variables influencing the extraction yield of polyphenols. The levels of the three variables were optimized by response surface methodology with central composite design. As a result, a polynomial regression and response surface plots were established indicating the effects of the studied variables on extraction efficiency. Moreover, the correlation between polyphenol concentration from Panax notoginseng flowers and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging ability was examined. Results: The optimal conditions for polyphenol extraction were determined as follows: extraction temperature, 75 ℃; extraction time, 47 min; and ethanol concentration, 48%. Under these conditions, the actual extraction rate of polyphenols was 58.95 mg/g, representing 98.44% of the predicted value. The correlation coefficient between DPPH radical scavenging ability and polyphenol yield was 0.757 208. Conclusion: Under the optimal conditions, the good agreement between predicted and observed extraction rates of polyphenols suggests the reliability of the predicted results. The strong correlation between DPPH radical scavenging ability and polyphenol yield demonstrates potent antioxidant activity of polyphenols from Panax notoginseng flowers.

Panax notoginseng flowers; polyphenol; response surface methodology; extraction; antioxidant

TS201.1

A

10.7506/spkx1002-6630-201510013

2014-10-23

菏澤學(xué)院植物學(xué)重點實驗室建設(shè)項目

朱素英(1980—),女,講師,碩士,研究方向為中草藥的活性成分。E-mail：zhu_suying@126.com