(威爾德(北京)香精有限公司,北京 100176)

同時(shí)蒸餾萃取和固相微萃取對(duì)雙孢蘑菇風(fēng)味物質(zhì)的提取分析

呂艷杰

(威爾德(北京)香精有限公司,北京 100176)

采用同時(shí)蒸餾萃取法和固相微萃取法對(duì)雙孢蘑菇的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析及鑒定。采用同時(shí)蒸餾萃取法鑒定出36 種化合物，采用固相微萃取法鑒定出34 種風(fēng)味化合物，2 種方法分析出蘑菇的特征風(fēng)味物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-辛烯-1-醇、2,6-二甲基吡嗪、2-戊基呋喃、甲基吡嗪、1-辛醇等，均以1-辛烯-3-醇含量最高。2 種提取方式相互補(bǔ)充相互驗(yàn)證。

雙孢蘑菇；同時(shí)蒸餾萃??；固相微萃取；氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用

蘑菇種類繁多，有香菇（Lentinus edodes）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、平菇（Pleurotus ostreatus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、竹蓀（Phallus indusiatus）等。蘑菇風(fēng)味鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、齊全的維生素、真菌多糖和礦物質(zhì)元素等[1-2]，它的蛋白質(zhì)含量通常約為干質(zhì)量的15%～35%，遠(yuǎn)高于一般的蔬菜[3]，并且必需氨基酸組成全面，氨基酸模式與人體接近[4]。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是我國(guó)培養(yǎng)最廣、產(chǎn)量最大的一種食用菌，也是目前世界上消費(fèi)量、養(yǎng)殖量最大的食用菌之一[5]。

蘑菇之所以為消費(fèi)者所喜愛，主要是它具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和特殊的鮮香風(fēng)味。蘑菇的風(fēng)味主要來自不揮發(fā)性含氮化合物和揮發(fā)性物質(zhì)[6]。其獨(dú)特的香味則取決于其所含的揮發(fā)性芳香物質(zhì)[7]。主要包括揮發(fā)性含碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯等[8]。蘑菇的風(fēng)味非常復(fù)雜，不能由單一物質(zhì)呈現(xiàn)，是多種組分在數(shù)量上平衡的綜合結(jié)果[9]。

不同品種的蘑菇，甚至同一蘑菇的不同生長(zhǎng)部位，其所含的香味成分也存在差異[10]。鄭建仙等[11-12]用同時(shí)蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）法提取分析香菇不同部位的風(fēng)味成分，從香菇傘部分離鑒定出64 種風(fēng)味化合物，從香菇柄部分離鑒定出42 種風(fēng)味化合物，發(fā)現(xiàn)這兩者的風(fēng)味組成雖有一定差異，但是主要的風(fēng)味成分（含硫化合物和八碳化合物）差異并不是很大，這一研究為香菇類產(chǎn)品的綜合利用提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。

隨著分離檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，各種先進(jìn)的提取分離技術(shù)開始應(yīng)用于蘑菇風(fēng)味的分析。張書香等[13-14]采用固相微萃?。╯olid phase micro extraction，SPME）技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用分析香菇揮發(fā)性香味成分，共檢測(cè)出43 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中含量較高的成分為二甲基二硫醚（3.36%）、二甲基三硫醚（13.36%）、1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷（3.70%）、1-辛烯-3-醇（1.11%）。GC-MS法也被應(yīng)用在白靈菇風(fēng)味成分分析[15]及平菇與香菇揮發(fā)性香味成分的分析[16]等。氣相色譜-嗅聞（gas chromatographyolfactometry，GC-O）是利用人的鼻子嗅聞經(jīng)氣相色譜柱分離后的各個(gè)餾分，以檢測(cè)樣品中的活性風(fēng)味物質(zhì)[17]。楊超等[18]運(yùn)用SDE方法對(duì)香竹竹葉中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取，利用GC-O與GC-MS聯(lián)用的法方對(duì)其中氣味活性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，共鑒定出29 種氣味活性物質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于雙孢蘑菇的研究多集中于對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、多糖及鮮味成分核苷酸的研究上[19-25]，而對(duì)于雙孢蘑菇風(fēng)味的研究與分析鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用SDE、SPME對(duì)雙孢蘑菇的風(fēng)味成分進(jìn)行分析，并利用GC-O-MS對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為雙孢蘑菇風(fēng)味料的開發(fā)研制提供技術(shù)參數(shù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇（鮮） 市購(gòu)；無水乙醚、正己烷、無水硫酸鈉（均為分析純） 北京化工廠；正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（C8～C26） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器及設(shè)備

多功能料理機(jī) 九陽股份有限公司；高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；同時(shí)蒸餾萃取裝置 美國(guó)Knotes公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司；6890-5973i氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SL型電子天平上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/ PDMS）萃取纖維和手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、40 mL固相微萃取專用樣品瓶 美國(guó)Supelco公司；Sniffer 9 000嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司。

1.3 方法

1.3.1 SDE法提取雙孢蘑菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)樣品制備

準(zhǔn)確稱取雙孢蘑菇鮮品100 g，切成約3 cm邊長(zhǎng)的小塊，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加500 mL去離子水。裝上SDE裝置，用電熱套加熱，保持蘑菇湯沸騰。另取30 mL無水乙醚溶液和30 mL正己烷溶液加入100 mL的圓底燒瓶中，以水浴鍋加熱，設(shè)置初始溫度為30 ℃，待電熱套中大圓底燒瓶中水沸騰再將溫度設(shè)置為40 ℃，提取3 h。冷卻至室溫，向有機(jī)萃取液中加入適量干燥處理（500 ℃，4 h）的無水硫酸鈉，塞進(jìn)瓶塞置于冰箱中24 h。

將提取液從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后，通過干燥的無水硫酸鈉層過濾至圓底燒瓶中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（溫度保持在40 ℃）至2 mL左右，然后用分析純N2吹掃至約1 mL待分析。

1.3.2 SPME法提取雙孢蘑菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

準(zhǔn)確稱取5.0 g雙孢蘑菇樣品，切丁后裝入40 mL樣品瓶中，在50 ℃的恒溫加熱磁力攪拌器中平衡1 h然后將CAR/PDMS（75 μm）萃取頭插入樣品瓶頂空部分，在60 ℃條件下萃取1 h后撥出，迅速插入GC-MS進(jìn)樣口，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS檢測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)條件

GC條件:色譜柱:DB-Wax毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣（純度99.99%）氦氣；流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；升溫程序:起始溫度35 ℃，保留5.0 min，以10 ℃/min升至85 ℃，保持1 min；進(jìn)樣量10 μL；分流比25∶1。

MS條件:電子電離源；離子源溫度220 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍45～500 u；電子能量70 eV。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性和定量分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性分析主要依據(jù)GC-MS分析獲得的總離子流色譜圖進(jìn)行分析鑒定。分離出的風(fēng)味化合物首先與GC-MS所配備的Wiley 6.0（32萬 個(gè)化合物）或NIST 98（10.7萬 個(gè)化合物）標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行匹配鑒定（要求匹配度不小于80），所得的風(fēng)味化合物在初步鑒定的基礎(chǔ)上盡可能與正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)（retention index，RI）（風(fēng)味化合物的RI通過正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（C8～C26）計(jì)算得到）或文獻(xiàn)中相同化合物的RI進(jìn)一步確認(rèn)，檢索確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用峰面積歸一法確定相應(yīng)物質(zhì)中各化合物的相對(duì)含量。

1.3.5 特征風(fēng)味物質(zhì)的GC-O-MS鑒定

嗅聞口傳輸線溫度250 ℃；火焰離子化檢測(cè)儀（flame ionization detector，F(xiàn)ID）和嗅聞口間分流比1∶1；載氣:氮?dú)?；載氣流速1.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；不分流模式。

GC-O檢測(cè):分3 個(gè)時(shí)間段（0～20、20～40、40～60 min）嗅聞，各時(shí)間段由3 個(gè)不同的感官評(píng)價(jià)員參與，每個(gè)人每個(gè)樣品分析3 次，共分析9 次，記錄氣味特征和保留時(shí)間。

香味提取稀釋分析:通過調(diào)節(jié)FID和嗅聞口間的分流比（1∶1、1∶10……）得到特征風(fēng)味物質(zhì)，（分流比是進(jìn)樣口通過軟件設(shè)置），以風(fēng)味稀釋因子（factor dilution，F(xiàn)D）為指標(biāo)，F(xiàn)D值越大則表明此風(fēng)味物質(zhì)對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大，當(dāng)FD=1時(shí)，則認(rèn)為此物質(zhì)對(duì)整體風(fēng)味的影響可以忽略。

2 結(jié)果與分析

采用SDE法和SPME法提取雙孢蘑菇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流圖（圖1）。各色譜圖經(jīng)質(zhì)譜圖人工解析，經(jīng)由GC-MS技術(shù)進(jìn)行風(fēng)味鑒定，結(jié)果如表1、2所示。

其中采用SDE提取雙孢蘑菇獲得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有36 種，檢測(cè)出1-辛烯-3-酮（0.30%）、2-甲基-3-辛酮（0.51%）、3-辛烯-2-酮（0.90%）、1-辛烯-3-醇（1.84%）、1-辛醇（0.40%）、2-辛烯-1-醇（0.33%），其中以1-辛烯-3醇含量最高，具有濃郁的蘑菇香味。這些風(fēng)味物質(zhì)在蘑菇中相互協(xié)調(diào)或者互補(bǔ)，共同組成了蘑菇的特有風(fēng)味。由GC-MS分析結(jié)合不同評(píng)價(jià)員對(duì)雙胞蘑菇的香氣描述以及RI，進(jìn)一步確認(rèn)鑒定出:蘑菇香味的5 種化合物，花香的3 種化合物，炒香的2 種化合物，甜香的3 種化合物，果香的2 種化合物，肉香、脂香的2 種化合物，其他的6 種化合物。

采用SPME提取雙孢蘑菇獲得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有34 種化合物。其中癸醛是最重要的風(fēng)味化合物，相對(duì)含量占總風(fēng)味物質(zhì)的32.23%。對(duì)蘑菇風(fēng)味影響最重要的八碳化合物，本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出正辛醛（0.31%）、1-辛烯-3-酮（0.48%）、2,3-二辛烯酮（0.63%）、3-辛烯-2-酮（2.14%）、2-辛烯醛（0.90%）、1-辛烯-3-醇（3.22%）、1-辛醇（0.49%）、2-辛烯-1-醇（0.33%）、2-丁基-2-辛烯醛（0.25%），其中以1-辛烯-3-醇含量最高，這與SDE提取雙孢菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果一致。其他的一些化合物如2-戊基呋喃具有甘草味或者果香味，2,5-二甲基吡嗪具有爆米花味，2,6-二甲基吡嗪具有巧克力味，對(duì)蘑菇風(fēng)味的形成起著協(xié)調(diào)或者互補(bǔ)的作用。由GC-MS分析結(jié)合不同評(píng)價(jià)員對(duì)雙胞蘑菇的香氣描述以及RI，進(jìn)一步確認(rèn)鑒定出:蘑菇香味的4 種化合物，花香的2 種化合物，炒香的2 種化合物，甜香的2 種化合物，果香的1 種化合物，青草味的2 種化合物，其他的4 種化合物。

采用2 種方法，鑒定出對(duì)雙孢蘑菇風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的幾類化合物48 種，其中包括醇類11 種、醛類11 種、酮類13 種、雜環(huán)化合物12 種、酸類1 種。2 種方法均檢測(cè)出的物質(zhì)有21 種，分別是3-甲基丁醛、正己醛、2-戊基呋喃、甲基吡嗪、正辛醛、1-辛烯-3-酮、2,6-二甲基吡嗪、正己醇、壬醛、3-辛烯-2-酮、1-辛烯-3-醇、糖醛、苯甲醛、1-辛醇、2-辛烯-1-醇、苯乙醛、苯乙酮、香葉基丙酮、苯甲醇、2-乙酰吡咯、二氫-5-戊基-2（3H）-呋喃。

蘑菇中的重要的八碳化合物SDE檢測(cè)出6 種，SPEM測(cè)得的蘑菇中的八碳化合物有9 種，均以1-辛烯-3醇含量最高。

3 結(jié) 論

從表1、2可知，采用SDE方法分離鑒定出的化合物和SPME獲得的揮發(fā)性成分從化合物的總數(shù)上看整體差別不大（SDE獲得揮發(fā)性風(fēng)味成分化合物36 種，SPME方式獲得34 種），但從分析出的化合物的組成上看差別很大，測(cè)定出的共同化合物僅有21 種（但蘑菇中重要的揮發(fā)性的香味物質(zhì)均測(cè)出）。

不同的萃取方式所獲得的揮發(fā)性化合物不盡相同，這是由萃取方法本身的特點(diǎn)所決定的，SDE萃取時(shí)間較長(zhǎng)，可以把香氣成分最大限度的萃取出來，而SPME是頂空吸附樣品的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分，所以對(duì)于半揮發(fā)性的成分的測(cè)定靈敏度偏低，同時(shí)因?yàn)槭茌腿☆^的限制，使用時(shí)間長(zhǎng)，固定液流失，吸附力隨之下降，從定量上講也要弱于SDE的方式。而從定性來講，SPME法由于其簡(jiǎn)單無破壞的特點(diǎn)對(duì)于揮發(fā)性化合物的鑒定更準(zhǔn)確，SDE法具有良好的重復(fù)性和較高的萃取量，適合于香精香味成分的定量分析；SDE法具有快速簡(jiǎn)便、不使用溶劑和樣品檢測(cè)非破壞性等優(yōu)點(diǎn)，適合于香精的剖析定性[26]。所以實(shí)驗(yàn)采用的2 種提取方式是相互補(bǔ)充相互驗(yàn)證。

以SDE和SPME 2 種提取方式分離出雙孢蘑菇的香味物質(zhì)并進(jìn)行了分析，為雙孢蘑菇香味物質(zhì)在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了可靠地?cái)?shù)據(jù)參考。然而由于時(shí)間和條件的限制，實(shí)驗(yàn)中仍存在一些問題需要深入研究。

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Comparative Application of SDE and SPME for Analysis of Aroma-Active Compounds in Button Mushroom (Agaricus bisporus)

L? Yanjie
(Wild Flavors (Beijing) Co. Ltd., Beijing 100176, China)

Aroma-active compounds in Agarucs bisporus were isolated by simultaneous distillation extraction (SDE) or solid phase micro extraction (SPME) and analyzed by gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry (GC-O-MS). A total of 36 and 34 kinds of aroma-active compounds were identified by SDE and SPME, respectively. The following characteristic flavor compounds were identified: 1-octene-3-ol, 1-octene-3-one, 2-octene-1-ol, 2,6-dimethyl pyrazine, 2-pentyl furan, methyl pyrazine, n-octanol etc. 1-Octene-3-ol was identified by both methods as the most abundant compound. The two extraction methods can be used to complement and validate each other.

Agaricus bisporus; simultaneous distillation extraction (SDE); solid phase micro extraction (SPME); gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry (GC-O-MS)

TS255.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510037

2014-11-25

呂艷杰(1977—),女,工程師,碩士,研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：roc530@sohu.com