夏小龍，彭 珍，劉書亮,2,*，韓新鋒,2，周 康,2，鄒立扣，賴海梅

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625014；2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 雅安 625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四川 都江堰 611830)

肉雞屠宰加工中減菌處理前后細(xì)菌菌相分析

夏小龍1，彭 珍1，劉書亮1,2,*，韓新鋒1,2，周 康1,2，鄒立扣3，賴海梅1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625014；2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 雅安 625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四川 都江堰 611830)

基于16S rDNA V6～V8可變區(qū)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)分析肉雞屠宰加工過程中減菌處理前后胴體或產(chǎn)品細(xì)菌多樣性。在預(yù)冷環(huán)節(jié)前采用50 ℃、1.5%乳酸溶液對肉雞胴體沖淋15 s進(jìn)行減菌處理，采集屠宰加工環(huán)節(jié)中減菌處理前后的胴體或分割產(chǎn)品表面樣品，提取樣品中的細(xì)菌總DNA，通過16S rDNA V6～V8可變區(qū)的PCR擴(kuò)增，變性梯度凝膠電泳，對PCR擴(kuò)增 片段割膠回收、克隆測序分析減菌前后細(xì)菌菌相變化。結(jié)果表明，減菌前，胴體清洗環(huán)節(jié)DGGE條帶的數(shù)量最多、亮度最 強(qiáng)，細(xì)菌污染最嚴(yán)重，其次是分割 環(huán)節(jié)，而預(yù)冷環(huán)節(jié)細(xì)菌種類及數(shù)量最少，污 染程度最低；減菌后，各屠宰加工環(huán)節(jié)細(xì)菌種類與數(shù) 量較減菌前均有所減少，其中胴體清洗環(huán)節(jié)與分割環(huán)節(jié)細(xì)菌的種類與數(shù)量減少量最多，預(yù)冷環(huán)節(jié)細(xì)菌的種類及數(shù)量最少，不同屠宰加工環(huán)節(jié)細(xì)菌種類并不完全一致；乳桿菌屬細(xì)菌在整個肉雞屠宰加工過程中均有出現(xiàn)，與腸桿菌科和假單胞菌屬細(xì)菌為肉雞屠宰加工過程中的優(yōu)勢腐敗菌。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳；肉雞；屠宰；減菌；細(xì)菌菌相

雞肉是世界上消費(fèi)量增長速度最快，物美價廉的優(yōu)質(zhì)肉類，其安全性愈發(fā)受到人們關(guān)注。健康雞肉組織內(nèi)部是沒有腐敗微生物與病原微生物污染的，然而肉雞在商業(yè)屠宰過程中，其皮膚、羽毛、消化道等均攜帶大量的天然菌群，肉雞胴體及其分割產(chǎn)品表面微生物的污染是不可避免的[1-2]。但在某些加工環(huán)節(jié)，如浸燙脫毛、預(yù)冷等環(huán)節(jié)，又能夠 有效減少微生物的數(shù)量[3]，而有些操作點(diǎn)也會成為交叉污染點(diǎn)。

目前，肉雞生產(chǎn)過程中微生物污染很多基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究微生物數(shù)量以確定污染源[4-5]。Ampe等[6]證 明至少25%～50%的微生物菌群不能有效地在外界培養(yǎng)，導(dǎo)致不能全面反映微生物分布的真正情況[7-8]。變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）可避免傳統(tǒng)微生物技術(shù)的缺陷，能更全面地認(rèn)識微生物分布，更加有效地分析微生物污染源[9-10]。本研究在彭珍等[11]對肉雞屠宰加工過程中肉雞胴體與產(chǎn)品的微生物污染分析及減菌研究基礎(chǔ)上，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術(shù)研究在肉雞商業(yè)屠宰加工過程中，預(yù)冷環(huán)節(jié)前使用乳酸結(jié)合熱水進(jìn)行減菌處理，分析減菌前后細(xì)菌菌相變化情況，旨在探究肉雞商業(yè)屠宰過程中細(xì)菌的分布、變化和減菌效果，為實(shí)際生產(chǎn)中的微生物污染控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川某肉雞屠宰加工廠生產(chǎn)鏈上(脫毛、掏膛、胴體清洗、預(yù)冷)的肉雞胴體以及分割、速凍后的肉雞產(chǎn)品。

TIANDZ柱式細(xì)菌DNAOUT 成都康迪生物技術(shù)有限公司；Premix Taq、Gold View核酸染料、DNA Marker DL2000、Agarose Gel DNA Purifcation Kit Ver.2.0、X-Gal、IPTG、Amp、pMD19-T載體 寶生物工程(大連)有限公司；0.1 mol/L磷酸鹽(pH 7.0)緩沖液、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、去離子甲酰胺、尿素、Tris、過硫酸胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、50×TAE緩沖液、6%丙烯酰胺變性膠、固定液、染色液、顯色液。

1.2 儀器與設(shè)備

DTSK-2401 220變性梯度凝膠電泳、PTC-200 PCR儀（My CyclerTMThermal Cycler）、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；B4i-BR4i冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 肉雞胴體及產(chǎn)品表面取樣

于肉雞屠宰加工廠用棉拭子擦拭法分別取脫毛、掏膛、胴體清洗、預(yù)冷的肉雞胴體表面、分割以及速凍環(huán)節(jié)的肉雞產(chǎn)品表面污染樣品。每支滅菌棉拭子涂2 個點(diǎn)，每點(diǎn)涂5 cm2，一個樣用5 支滅菌棉拭子涂擦，共涂擦50 cm2（頭肛部各5 cm2、背部10 cm2、雞翅和雞腿各5 cm2、胸部10 cm2、腹部10 cm2）[12]涂后放入裝有50 mL磷酸鹽的EP管中，于冰盒（4 h內(nèi)）運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 減菌處理方法

采用50 ℃、1.5%乳酸溶液在預(yù)冷環(huán)節(jié)前對肉雞胴體沖淋15 s（以秒表計時）進(jìn)行減菌處理[11]，每次沖淋12 只肉雞，分3 個批次沖淋，共沖淋36 只肉雞，并分別在胴體清洗后、預(yù)冷后、分割后及速凍后環(huán)節(jié)，用棉拭子擦拭法按1.3.1節(jié)取樣。

1.3.3 樣品預(yù)處理

將棉拭子在裝有磷酸鹽的50 mL離心管中，浸提30 min左右后取出，然后將離心管于3 000 r/min離心3 min，去除底部雜質(zhì)，上清液再于12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，得菌體沉淀。

收集的菌體用5 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）懸浮，9 000 r/min離心10 min，重復(fù)洗滌3 次，洗凈的菌體懸浮在5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，用移液器吹打后振蕩器振蕩均勻，平均分裝3 份于2 mL 離心管中，-20 ℃凍存。

1.3.4 細(xì)菌總DNA提取

按照細(xì)菌DNA提取試劑盒使用說明提取細(xì)菌總DNA。將提取的細(xì)菌總DNA溶于100 μL的Tris-EDTA緩沖液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 PCR反應(yīng)

用細(xì)菌16S rDNA V6～V8可變區(qū)通用引物，其上游引物為帶有GC夾子的U968，下游 引物是L1401[13]。U968-GC夾子為:5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG-GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’。下游引物L(fēng)1401為:5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’。上述引物均由成都微克天泰技術(shù)有限公司合成提供。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）:DNA 模板1、0.5 μL的引物（10 μmol）、預(yù)混體系25 μL、超純水23 μL；PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min，35 個循環(huán)（94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），最終72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將擴(kuò)增產(chǎn)物放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 DGGE分析

1.3.6.1 PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離

參照Muyzer等[9]的方法，對細(xì)菌16S rDNA的V6～V8區(qū)段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析并作改進(jìn)。6 g/100 mL丙烯酰胺（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺），變性劑溶液線性梯度范圍為45%～55%，先200 V電壓條件下預(yù)電泳30 min，再在120 V電壓條件下電泳16 h。

1.3.6.2 銀染與圖譜分析

DGGE電泳結(jié)束后，取出膠板，將凝膠取下先用固定液固定20～30 min，去離子水快速清洗2 次，再用AgNO3溶液避光搖床染色20～30 min，染色結(jié)束后，將凝膠從染色液中取出，用去離子水快速清洗2 次，再將凝膠放入已預(yù)冷的顯影液中搖床顯影，條帶顯色完全后，迅速取出凝膠，將其放于凝膠成像儀上成像。

1.3.6.3 克隆及序列分析

選取圖譜中清晰、明亮的優(yōu)勢條帶按照Agarose Gel DNA Purifcation Kit Ver.2.0試劑盒說明割膠回收，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后再割膠回收，按DP214-03 Universal DNA Purification Kit試劑盒操作回收純化目的條帶，然后再取2 μL不含GC夾子的引物進(jìn)行16S rDNA的V6～V8可變區(qū)域擴(kuò)增，擴(kuò)增后電泳檢測、再將目的條帶回收純化，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，再連接、轉(zhuǎn)化進(jìn)行T克隆后，挑白斑菌落活化12～14 h后，將菌液送于上海英俊生物科技有限公司進(jìn)行測序，將序列登錄NCBI，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行相似性比對。將所有序列用ClustalX（1.81）比對后，用NYSYS2軟件進(jìn)行DGGE圖譜的聚類分析，最后再用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA提取及PCR擴(kuò)增

用試劑盒提取方法對樣品總DNA進(jìn)行提取，電泳結(jié)果如圖1所示，可以看出，樣品的總DNA提取效果較好，電泳條帶清晰可見。

以提取的總DNA為模板 ，采用U968-GC、L1401對各個樣品中細(xì)菌16S rDNA V6～V8可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳圖如圖2所示，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，特異性好，位于500 bp左右，均符合目的條帶約450 bp片段長度的要求。

2.2 DGGE分析

根據(jù)DGGE基本原理，圖譜中的每一根條帶都對應(yīng)于微生物群落中一個優(yōu)勢菌群或操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）[14]，且圖譜中條帶數(shù)量的多少反映了樣品中微生物組成的差 異，條帶的亮度反映了樣品中微生物的多少。對減菌前后肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中脫毛、掏膛、胴體清洗、預(yù)冷、分割、速凍后的6 個環(huán)節(jié)的肉雞胴體或產(chǎn)品表面細(xì)菌的DGGE圖譜見圖3?？梢钥闯?，經(jīng)不同加工環(huán)節(jié)后的肉雞胴體或產(chǎn)品表面的細(xì)菌DGGE圖譜存在一定的差異，且經(jīng)50 ℃、1.5%乳酸溶液對肉雞胴體沖淋15 s處理后4 個環(huán)節(jié)中肉雞胴體或產(chǎn)品表面細(xì)菌的種類和數(shù)量均所減少，為進(jìn)一步分析肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)以及多樣性，將圖3中所標(biāo)記的11 條較明顯的條帶回收純化、電泳檢測、克隆測序結(jié)果見表1。

圖3表明，在1～6肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)中，不同加工環(huán)節(jié)之間細(xì)菌的種類與數(shù)量均有所差異。同一加工環(huán)節(jié)，不同條帶的亮度也有所差異，說明不同種類的細(xì)菌數(shù)量不同。胴體清洗環(huán)節(jié)樣品（標(biāo)號3）條帶的數(shù)量最多、亮度最強(qiáng)，故該環(huán)節(jié)的細(xì)菌種類最為豐富、數(shù)量最多，細(xì)菌污染最嚴(yán)重；其次是分割環(huán)節(jié)樣品（標(biāo)號5）中的細(xì)菌種類較豐富、數(shù)量較多；掏膛環(huán)節(jié)（標(biāo)號2）中的細(xì)菌種類也較脫毛環(huán)節(jié)（標(biāo)號1）豐富，數(shù)量較多；速凍環(huán)節(jié)（標(biāo)號6）中的條帶數(shù)量較少，主要為幾種優(yōu)勢嗜冷菌；預(yù)冷環(huán)節(jié)（標(biāo)號4）中的條帶數(shù)量最少，亮度最弱，該環(huán)節(jié)細(xì)菌的種類與數(shù)量是肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)中最少的，也是細(xì)菌污染最輕的環(huán)節(jié)。

從圖3的3-3’、4-4’、5-5’與6-6’對應(yīng)加工環(huán)節(jié)減菌處理前后的DGGE圖譜可以看出，采用50 ℃ 1.5%乳酸溶液減菌處理后，每個環(huán)節(jié)條帶的數(shù)量均有較大程度的減少，條帶的亮度也均有減弱，有些條帶甚至消失。在胴體清洗環(huán)節(jié)與分割環(huán)節(jié)，經(jīng)減菌處理后條帶的數(shù)量減少最多，亮度減弱程度最大。而在預(yù)冷環(huán)節(jié)，減菌后幾乎所有的條帶均消失，僅存的條帶亮度也很弱。綜上可知，在肉雞屠宰加工過程中該減菌方法能有效減少胴體及產(chǎn)品表面的細(xì)菌種類與數(shù)量。圖4為所有樣品DGGE圖譜的聚類分析圖，樣品3’、5’與6最為相似，首先聚在一起，相似性高達(dá)0.88，說明胴體清洗和分割這2 個污染最為嚴(yán)重環(huán)節(jié)經(jīng)減菌處理后，其樣品中微生物種類的多樣性與分割后速凍產(chǎn)品接近，這說明該處理對這2 個環(huán)節(jié)的污染控制起到了良好的效果。樣品1、2相似度為0.88，但樣品6’與其他樣品相似度最低為0.49，可能是由于減菌處理后，樣品表面部分微生物被殺滅，得到有效控制，致使該環(huán)節(jié)微生物種類最少。從圖4的3-3’、4-4’、5-5’與6-6’對應(yīng)加工環(huán)節(jié)減菌處理前后PCR-DGGE聚類分析圖可知，3-3’、5-5’樣品之間，減菌后樣品的相似度較減菌前樣品的相似度高0.06；4-4’樣品之間的相似度均為0.75，減菌前后微生物的種類基本保持一致；6-6’樣品之間的相似度差異最大，減菌前樣品較減菌后樣品的相似度高0.39，這可能是由于速凍環(huán)節(jié)的低溫造成部分種類微生物死亡，導(dǎo)致微生物種類減少。

結(jié)合圖3和表1可以看出，在不同加工環(huán)節(jié)的肉雞胴體表面所取的樣品中均存在一條明顯的共有條帶（標(biāo)記為a），測序結(jié)果表明條帶a是乳桿菌屬（Lactobacillus），乳桿菌屬的最適生長溫度范圍為30～40 ℃，其廣泛分布于環(huán)境中，特別是動物、蔬菜及食品中，常寄主于鳥和脊椎動物的消化道以及哺乳動物的尿道，是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。DGGE圖譜顯示，肉雞胴體及分割產(chǎn)品表面主體細(xì)菌（條帶a）含量較多，其他優(yōu)勢菌種在不同的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中豐度有所差異。胴體清洗環(huán)節(jié)樣品（標(biāo)號3）條帶的數(shù)量最多、亮度最強(qiáng)，意味著此環(huán)節(jié)的細(xì)菌種類最為豐富、數(shù)量最多。條帶b為不可培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium），在胴體清洗環(huán)節(jié)和預(yù)冷環(huán)節(jié)數(shù)量較多，減菌處理后，在胴體清洗環(huán)節(jié)消失，但在預(yù)冷環(huán)節(jié)又生長，很可能是由于預(yù)冷池中的水交叉污染所致。條帶c為腸桿菌科細(xì)菌（Enterobacteriaceae bacterium），由圖3可以看出，在肉雞生產(chǎn)鏈中調(diào)查的6 個環(huán)節(jié)中，均有腸桿菌科 細(xì)菌的存在，但在胴體清洗環(huán)節(jié)、分割環(huán)節(jié)和速凍環(huán)節(jié)存在的數(shù)量較多，在其他環(huán)節(jié)條帶c亮度較弱；減菌處理后條帶c的亮度明顯減弱，說明乳酸結(jié)合熱水沖淋肉雞胴體能有效減少腸桿菌科細(xì)菌。條帶d、f分別是不可培養(yǎng)梭菌（uncultured Clostridiales bacterium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus），同樣也是在胴體清洗環(huán)節(jié)條帶亮度最強(qiáng)，說明這2種菌的含量較高。條帶e、g均為不可培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium），在脫毛環(huán)節(jié)、胴體清洗環(huán)節(jié)和分割環(huán)節(jié)污染也較嚴(yán)重，減菌處理后速凍環(huán)節(jié)兩條帶的亮度也幾乎消失。條帶h為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），由圖3可以看出，在肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中的胴體清洗環(huán)節(jié)、分割環(huán)節(jié)和速凍環(huán)節(jié)污染較嚴(yán)重，減菌處理后在分割環(huán)節(jié)假單胞菌屬的數(shù)量有所減少，但速凍后數(shù)量又有所上升，可能是分割環(huán)節(jié)中由于環(huán)境、刀具等的交叉污染所引起的。在脫毛、掏膛、胴體清洗、分割環(huán)節(jié)還有熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（條帶i）的存在，減菌處理后，條帶i的亮度明顯減弱，說明處理后此種細(xì)菌的數(shù)量明顯減少。條帶j為不可培養(yǎng)瘤胃球菌屬（uncultured Ruminococcus sp.），處理后，其數(shù)量相對于減菌前也明顯減少。條帶k為不可培養(yǎng)假單胞菌屬（uncultured Pseudomonas sp.），在胴體清洗環(huán)節(jié)和速凍環(huán)節(jié)污染較嚴(yán)重。

圖5為減菌前后肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中胴體表面所取樣品經(jīng)DGGE分析后所分離純化細(xì)菌的微生物系統(tǒng)發(fā)育樹，不同環(huán)節(jié)的肉雞胴體表面的微生物污染存在差異性。菌k和h的親緣關(guān)系比較近，菌k是在胴體清洗環(huán)節(jié)和速凍環(huán)節(jié)出現(xiàn)的細(xì)菌，菌h在調(diào)查的6 個環(huán)節(jié)中均有出現(xiàn)；菌h和i、k是也是同一屬的菌群，均是假單胞菌屬，i在胴體清洗和分割環(huán)節(jié)數(shù)量較多。

3 結(jié)論與討論

PCR-DGGE技術(shù)可檢測出肉雞屠宰生產(chǎn)鏈關(guān)鍵環(huán)節(jié)中的肉雞胴體表面細(xì)菌菌相的多樣性,DGGE圖譜顯示,采用50 ℃、1.5%乳酸溶液在預(yù)冷環(huán)節(jié)前對肉雞胴體沖淋15 s進(jìn)行減菌處理,減菌后在對應(yīng)肉雞加工環(huán)節(jié)大多數(shù)條帶的亮度有所減弱,且條帶數(shù)目也有所減少,由此可知,肉雞胴體表面的細(xì)菌種類及數(shù)量較減菌前均有所減少。預(yù)冷環(huán)節(jié)后,細(xì)菌的種類與數(shù)量是整個肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)最低的,說明預(yù)冷環(huán)節(jié)能有效減少細(xì)菌的種類和數(shù)量,但也應(yīng)當(dāng)及時更新預(yù)冷池中的水,防止交叉污染。經(jīng)預(yù)冷后,肉雞進(jìn)入分割車間,細(xì)菌的種類和數(shù)量均增加,引起細(xì)菌菌相發(fā)生變化,在實(shí)際生產(chǎn)過程中采取適當(dāng)?shù)那逑?、消毒手段可有效控制交叉污染造成的微生物污染?/p>

本實(shí)驗(yàn)中DGGE圖譜顯示不可培養(yǎng)梭菌(uncultured Clostridiales bacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)在除預(yù)冷環(huán)節(jié)外均有發(fā)現(xiàn)。這與Gong Jianhua等[15]研究結(jié)果相符,其發(fā)現(xiàn)Clostridiales和Ruminococcus在肉雞盲腸中分別占所有菌群的40%和6%。在肉雞胴體表面被檢測出的原因可能是由于盲腸在掏膛環(huán)節(jié)被弄破,導(dǎo)致腸道菌群在胴體清洗時被沖洗到肉雞胴體表面,但在處理后條帶亮度明顯減弱,且處理后在速凍環(huán)節(jié)這2 條帶幾乎消失,說明減菌處理后,這2 種菌的數(shù)量明顯減少。此外,乳桿菌屬、腸桿菌科與假單胞菌屬細(xì)菌是肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)中的優(yōu)勢腐敗菌。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)法是應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基 篩選特定的某一類微生物,根據(jù)菌數(shù)來判斷優(yōu)勢菌的變化情況[16-18],工作量大而又繁瑣,且鑒定的微生物種類十分有限。PCRDGGE技術(shù)也存在固有的局限性[19],但可以通過測序分析鑒定微生物的種類,包括部分不可培養(yǎng)細(xì)菌,對微生物的多樣性以及變化情況認(rèn)識更加清晰、準(zhǔn)確。孫彥雨等[20]為避開傳統(tǒng)培養(yǎng)法與PCR-DGGE技術(shù)的局限性,采用二者相結(jié)合的方法,確定乳酸菌、大腸菌群、肉桿菌、腐敗希瓦氏菌以及熱殺索絲菌為冰鮮雞肉中腐敗優(yōu)勢菌,該結(jié)果與梁榮蓉[21]以及本研究結(jié)果存在一定的差異,這可能是由于不同肉雞屠宰加工企業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的不同與管理水平的高低造成的。

我國GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中食品工業(yè)用加工助劑使用規(guī)定，乳酸可作為各類食品加工助劑使用且殘留量不需限定。美國食品藥物管理局現(xiàn)已批準(zhǔn)1.5%～2.5%有機(jī)酸如乳酸、檸檬酸等可用于禽類加工企業(yè)中[22]。1992年，美國農(nóng)業(yè)部允許劑量為8%～12%抗菌劑磷酸三鈉以噴涂或浸漬的方式用于健康無病的生冷禽類胴體，浸漬時間不超過15 s。Bourassa等[23]研究也證實(shí)，經(jīng)100 g/L磷酸三鈉溶液處理的肉雞經(jīng)過45 min預(yù)冷后，其沙門氏菌減少率為40%。孫京新等[24]用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳酸、不同溫度的熱水和以不同的噴淋時間研究對豬肉肉色以及去微生物污染的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、溫度45 ℃、時間60 s和乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%、溫度35 ℃、時間60 s時對豬肉肉色影響不顯著，但對大腸桿菌和沙門氏菌的致死效果均顯著。其結(jié)果與彭珍等[11]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近但又有所差異，可能是由于處理的樣品對象不同。國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果普遍認(rèn)為，多柵欄因子減菌工藝在畜禽屠宰加工生產(chǎn)線上應(yīng)用時，會顯著地減少微生物種類和數(shù)量[25-26]。本研究在肉雞屠宰加工中預(yù)冷環(huán)節(jié)前使用乳酸結(jié)合熱水進(jìn)行減菌處理，采用PCR-DGGE技術(shù)分析其減菌處理前后細(xì)菌菌相變化規(guī)律，較為可靠、清晰地認(rèn)識了該企業(yè)肉雞屠宰加工過程中細(xì)菌菌相的分布、變化情況，同時直觀地反映了該減菌方法的減菌效果，為實(shí)際生產(chǎn)中微生物污染的防控提供了一定的理論依據(jù)。

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Bacterial Flora before and after Bacterial Reduction during Slaughtering and Processing Broiler Chickens

XIA Xiaolong1, PENG Zhen1, LIU Shuliang1,2,*, HAN Xinfeng1,2, ZHOU Kang1,2, ZOU Likou3, LAI Haimei1
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Preservation Engineering of Sichuan Province, Ya’an 625014, China; 3. Laboratory of Microbiology, Dujiangyan Campus of Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China)

The bacterial diversity of carcasses or products of broiler chickens before and after bacterial reduction during slaughter and processing was analyzed by polymerase chain reaction (PCR) amplification and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) based on the V6–V8variable regions of 16S rDNA. Broiler carcasses were rinsed with 1.5% lactic acid solution at 50 ℃ for 15 s for reducing bacteria before the pre-cooling treatment. Bacterial total DNA was extracted from the samples collected from the surface of carcasses or carcass parts before and after bacterial reduction during chicken slaughter and processing and the V6–V8regions of 16S rDNA were amplifi ed by PCR using a universal primer. The bacterial community structure was analyzed by DGGE. The results showed that the largest number of bands with the highest brightness in the DGGE profile was observed during carcass cleaning before bacterial reduction, indicating the most serious bacterial contamination, followed in turn by carcass segmentation and pre-cooling where the lowest bacterial count and the smallest number of bacterial species were obtained suggesting minimum bacterial contamination. After bacterial bacteria, both the total bacterial count and the number of bacterial species were reduced during slaughte ring and processing, as compared with those observed before bacterial bacteria. The largest reduction in the two parameters was found during both carcass cleaning and segmentation, and the smallest reduction during the pre-cooling sta ge. The bacterial species were not entirely consistent during the slaughter and processing of broilers, and Lactobacillus was found throughout the entir e process as the predominant spoilage bacteria together with Pseudomonas sp. and Enterobacteriaceae.

PCR-DGGE; chickens; slaught e r; bacterial reduction; bacterial microfl ora

TS251.8

A

10.7506/spkx1002-6630-201510038

2014-06-09

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903055)

夏小龍(1989—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：xiaolongxia1205@163.com

*通信作者：劉書亮(1968—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：lsliang999@163.com