蒲承君，崔興博，杜蘭蘭，雷 婭，張宏宇，劉 芳，董慶利，劉 箐,*

（1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；2.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生 保健中心，甘肅 蘭州 730020）

市售生鮮雞肉5 種主要食源性致病菌污染檢測及分布概率評估

蒲承君1，崔興博1，杜蘭蘭1，雷 婭1，張宏宇1，劉 芳2，董慶利1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；2.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生 保健中心，甘肅 蘭州 730020）

采用聚合酶鏈式反應技術對上海市52 個市場的208 份雞腿、雞爪、雞翅、雞胗、雞胸肉中出血性大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌5 種食源性致病菌進行快速檢測，以了解不同雞肉食用部位各種致病菌的分布規(guī)律，并根據(jù)β概率分布確立最具代表性的部位作為評估靶點。結(jié)果顯示:在208 份樣品中，大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌未檢出；阪崎腸桿菌在雞翅中檢出1 株；志賀氏菌檢出2 株，分布于雞翅、雞胗；單增李斯特菌檢出11 株，檢出率達5.29%，且在雞翅中檢出率最高（4 株），雞腿（3 株）、雞爪（3 株）部位檢出率相當，雞胗檢出率最低（1 株）。

聚合酶鏈式反應；致病菌；生鮮雞肉；β概率分布；評估靶點

食源性致病菌如沙門氏菌、單增李斯特菌等是造成食源性疾病爆發(fā)的主要原因[1]。我國2000—2006年衛(wèi)生部發(fā)布的食物中毒公告顯示，微生物性危害導致的食物中毒人數(shù)占總中毒人數(shù)的51.33%，大約是化學性危害導致中毒人數(shù)的212 倍[2]。這些由致病菌所引發(fā)的急性食物中毒常出現(xiàn)惡心、腹痛、腹瀉、發(fā)燒等癥狀，重者威脅呼吸、循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)，甚至留下后遺癥[3-6]。

在食源性致病菌調(diào)查中，一般采取隨機取樣的方法，但對取樣部位并沒有明確的規(guī)定。一般隨機以某種肉制品的某個部位作為整體的代表取樣檢測，進而對致病菌的污染狀況進行評價。但按照致病菌侵染機理，動物組織攜帶細菌數(shù)量應該有所區(qū)別，目前這種對采樣部位沒有明確規(guī)定，隨機抽樣可能存在以偏概全、盲人摸象的弊端，不僅容易造成致病菌監(jiān)測漏檢[7-8]，而且不能為食源性致病菌的風險評估和預警提供準確、科學的數(shù)據(jù)。高巍等[9]通過對生長豬胃腸道不同區(qū)段的益生菌分布數(shù)量及規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌在胃腸道不同區(qū)段的分布數(shù)量是不同的，但雞肉不同食用部位致病菌分布有何特點，仍然缺乏基礎研究數(shù)據(jù)。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）作為一種新的快速檢測方法，被廣泛應用于各種微生物的快速檢測，具有快速、高效、定量、靈敏的特點[10]。本項目從上海市52 個市場上采集了雞翅、雞腿、雞爪、雞胗、雞胸肉共208 份樣品，利用出血性大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157:H7） rfbE基因、沙門氏菌（Salmonella spp.）invA基因、志賀氏菌（Shigella spp.）iapH基因、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)hly基因、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）16S rRNA基因作為特異性引物進行PCR檢測，希望通過大量樣品的快速檢測，尋找一種可代表致病菌污染水平的部位，探討以最具代表性的食用部位作為致病菌的評估靶點，建立準確預警系統(tǒng)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

雞翅、雞腿、雞爪、雞胗、雞胸肉購于閔行歐尚超市等上海市52 個超市或菜市場。

ATCC標準菌株由上?；墼派锟萍加邢薰举浰?標準菌株列表如表1所示。

改良EC肉湯（modified EC broth，mEC+n）、改良山梨醇麥康凱瓊脂（modifi ed sorbitol maconkey agar，CT-SMAC）、緩沖蛋白胨（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（tetrathionate broth，TTB）、亞硒 酸鹽胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（bis muth sulfite agar，BS）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（xylose lysine desoxycholat e agar，XLD）、志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（modified lauryl sulfate tryptosebroth，MLST）、萬古霉素溶液、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基、李氏增菌肉湯LB1、李氏增菌肉湯LB2、PALCAM選擇性培養(yǎng)基、PALCAM選擇性添加劑、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）北京陸橋技術有限責任公司；PCR的10 倍緩沖液，dNTP（2.5 mmol）、Taq DNA Polymerase（5 U/μL）、MgCl2（25 mmol）、loading buffer（6×）、100 bp ladder DNA Marker 生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-70生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；G560E振蕩器 上海凡勁儀器設備有限公司；Gene Amp?PCR system 9700、凝膠成像系統(tǒng) 美國基因有限公司。

1.3 引物

引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列如表2所示。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

在無菌操作條件下用刀切碎樣品，并稱取檢測樣品25 g于自封袋中，每袋分別倒入225 mL已滅菌的前増菌肉湯液體培養(yǎng)基，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2 min，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。每種樣品分別按GB/T 4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗:大腸埃希氏菌O157∶H7 NM檢驗》[15]、GB 4789.4—2010《食品微生物學檢驗:沙門氏菌檢驗》[16]、GB 4789.40—2010《食品微生物學檢驗:阪崎腸桿菌檢驗》[17]、GB 4789.30—2010《食品微生物學檢驗:單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[18]、GB 4789.5—2012《食品微生物學檢驗:志賀氏菌檢驗》[19]檢測，并分離至選擇性培養(yǎng)基上。

1.4.2 PCR體系配制

從選擇性培養(yǎng)基上挑取可疑單菌落進行搖床培養(yǎng)12～18 h，用PCR方法鑒定（挑取可疑菌落后，無需提取DNA，PCR循環(huán)開始前，細菌經(jīng)95 ℃高溫裂解后可釋放DNA）。PCR反應體系如表3所示。

1.4.3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

將PCR擴增后的產(chǎn)物用1.5%（80 mL 0.5×TAE中加1.2 g瓊脂糖）的瓊脂糖凝膠電泳分離，取10 μL PCR產(chǎn)物與2 μL 6×loading buffer混合后點樣，100 V電泳40 min，取出凝膠，在凝膠成像儀上觀察。

1.4.4 菌株凍存

目的菌經(jīng)檢出后，菌液與甘油以1∶1混合存于經(jīng)滅菌后的凍存管中，放-80 ℃保存。

1.4.5 β概率分析

通過當前實際取樣檢測的數(shù)值推測上海市整體的致病菌分布的概率情況。一般來說，陽性率推測總體符合β函數(shù)的概率分布，β(α1，α2)表達式中β分布，具有形狀參數(shù)α1和α2，一般對應著:

α1= S+1，α2= n-S+1

式中:n是當前取樣數(shù)；S是陽性檢出數(shù)。以@Risk軟件定義β分布，即可得到95%置信區(qū)間的概率。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性培養(yǎng)基分離結(jié)果

樣品經(jīng)分離至選擇性培養(yǎng)基上所得菌落形態(tài)如圖1所示。樣品共計208 份，出現(xiàn)出血性大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌可疑菌落的平板分別為126、141 個，出血性大腸桿菌O157∶H7在山梨醇麥康凱瓊脂平板上，典型菌落中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色，邊緣無色，沙門氏菌在亞硫酸鉍瓊脂平板上，典型菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色，但經(jīng)PCR鑒定后均非目標菌（圖1中未顯示）；出現(xiàn)志賀氏菌可疑菌落的平板共計148 個，其中1號平板為陽性對照，2、3號平板分別為閔行歐尚超市的雞胗、內(nèi)江支路菜市場的雞翅，典型菌落呈粉紅色至無色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊；出現(xiàn)阪崎腸桿菌可疑菌落的平板共計65 個，其中4號平板為陽性對照，5號平板為龍江菜市場的雞翅，典型菌落呈藍綠色，不透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊；出現(xiàn)單增李斯特菌可疑菌落的平板共計78 個，6號平板為陽性對照，7～17號平板為所測部分樣品，典型菌落為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。

2.2 PCR檢測結(jié)果

對2.1節(jié)中出現(xiàn)可疑菌落的平板進行PCR鑒定，通過凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，最終檢出2 株志賀氏菌，分別分布于歐尚超市雞胗（圖2中3號泳道）、內(nèi)江支路菜市場雞翅（圖3中6號泳道），大小為629 bp；阪崎腸桿菌檢出1 株，分布于龍江菜市場雞翅（圖4中5號泳道），大小為282 bp；單增李斯特菌檢出11 株，分別分布于鳳城農(nóng)貿(mào)市場雞爪、雙遼菜市場雞翅、揚州路農(nóng)貿(mào)市場雞翅、引翔港菜市場雞翅、國太菜市場雞爪、東安菜市場雞爪、周家嘴蓮花超市雞腿、阜新菜市場雞翅、國太菜市場雞腿、國京菜市場雞爪、心誠農(nóng)貿(mào)市場雞胗（圖5中2、3、5、6、8～14號泳道），大小為234 bp。

綜上，此次致病菌檢出情況為:單增李斯特菌＞志賀氏菌＞阪崎腸桿菌＞沙門氏菌=出血性大腸桿菌O157∶H7。

2.3 雞肉各部位致病菌分布情況

由表4可知，雞翅受致病菌污染最嚴重，雞胸肉污染較輕，但由于雞胸肉采樣量太少，難以此結(jié)果作為致病菌污染的評估靶點。綜合雞翅、雞腿、雞爪、雞胗進行分析，其受污染的嚴重程度依次為:雞翅＞雞腿=雞爪＞雞胗。

2.4 通過β概率分布獲得的總體推測平均值

表5為β概率分布結(jié)果，志賀氏菌在雞翅、雞胗中95%的置信區(qū)間上陽性檢出可分別達到8.64%、9.32%，單增李斯特菌在雞翅、雞腿、雞爪、雞胗中95%的置信區(qū)間上陽性檢出可分別達到16.44%、13.98%、13.98%、9.32%，阪崎腸桿菌在雞翅中95%的置信區(qū)間上陽性檢出為8.64%。

綜上可知，在95%置信區(qū)間，單增李斯特菌在雞翅中檢出率最高，可作為原料雞肉最具代表性的食用部位，以此為致病菌的風險評估提供一定的理論依據(jù)。

3 討 論

目前，原料雞肉受沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7的污染最為嚴重[20-21]。單增李斯特菌對低溫具極強耐受性，據(jù)Valero等[22]對豬肉中沙門氏菌和單增李斯特菌的分布進行研究，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌在6、7、8月份檢出率最高，在11月至次年4月檢出率極低，單增李斯特菌在2月仍能檢出。從此次上海市所采集食用原料雞肉各部位（雞翅、雞腿、雞爪、雞胗、雞胸）共計208 份樣品來看，大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌均未檢出，志賀氏菌、阪崎腸桿菌檢出率極低，分別為0.96%、0.48%，單增李斯特菌檢出率較高，達5.29%。

大多食源性致病菌均能引起胃腸炎、敗血癥等疾病[3,23-24]。單增李斯特菌能夠通過宿主腸屏障和一系列的靶器官進行移植，隨淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)進入肝、脾，并在肝中繁殖[25-26]，但就此次單增李斯特菌在雞肉不同部位的分布情況而言，雞翅檢出率最高，雞腿、雞爪的檢出率相當，在雞胗中檢出率卻極低，受禽流感影響，雞肝在上海各大菜場并不常見，因此，對于單增李斯特菌在雞肝中的分布規(guī)律并未作探討。Sasaki等[27]對家禽產(chǎn)品中單增李斯特菌的污染情況做了相關調(diào)查，發(fā)現(xiàn)家禽產(chǎn)品在禽產(chǎn)品加工廠內(nèi)已經(jīng)受到了單增李斯特菌的污染，但在雞胸肉中的檢出率卻明顯高于雞肝，本研究由于雞胸僅采集樣品4份，數(shù)量較少，難以統(tǒng)計出單增李斯特菌在雞胸肉中的污染情況。孫曉明等[28]通過對萊陽市4 個雞肉銷售市場的雞肉各部位（雞脖、雞翅、雞腿、雞爪、雞肝）的致病菌（沙門氏菌、亞利桑那菌、大腸桿菌）進行研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌檢出率最高，就檢出部位而言，雞爪受致病菌污染最為嚴重，雞翅污染最輕。王歡等[29]對合肥市4 家超市的冰鮮雞肉各部位（雞翅、雞爪、雞胸肉）的菌落總數(shù)進行測定，發(fā)現(xiàn)雞翅受微生物污染最嚴重，和本實驗的結(jié)果一致，但對于微生物易分布于雞翅的機理，仍缺乏相關研究。本研究所調(diào)查5 種致病菌在雞翅中檢出率最高，達11.54%，可作為雞肉中致病菌污染的評估靶點。按照國標規(guī)定致病菌不得檢出，從本實驗結(jié)果來看，上海市市售雞肉常見部位均受到志賀氏菌、阪崎腸桿菌及單增李斯特菌的污染，存在一定的安全隱患。

[1] SCHMELCHER M, LOESSNER M J. Application of bacteriophages for detection of foodborne pathogens[J]. Bacteriophage, 2014, 4: e28137.

[2] 劉秀梅. 我國食品衛(wèi)生微生物學30 年來的熱點研究及主要進展[J].中國食品衛(wèi)生雜志, 2009, 21(4): 289-290.

[3] PARRY C M, THOMPSON C, VINH H, et al. Risk factors for the development of severe typhoid fever in Vietnam[J]. BMC Infectious Diseases, 2014, 14: 73.

[4] 蔣小平, 鄧思敏, 鐘巍, 等. 大腸埃希菌O157:H7致病因素的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2012, 40(11): 6531-6533.

[5] ZHAI L G, KONG X H, LU Z X, et al. Detection of Salmonella enterica serovar Dublin by polymerase chainreaction in multiplex format[J]. Journal of Microbiological Methods, 2014, 100: 52-57.

[6] 胡光春, 楊月蓮, 劉輝, 等. 阪崎腸桿菌致病性及致病機理研究進展[J].中國病原生物學雜志, 2011, 6(8): 626-628.

[7] 袁寶君, 戴建華, 喬昕, 等. 2007年江蘇省食源性致病菌監(jiān)測分析[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2009, 21(2): 114-116.

[8] 王卓, 李德華, 周漢洪, 等. 2010年達州市食源性致病菌監(jiān)測[J]. 預防醫(yī)學情報雜志, 2012, 28(8): 631-634.

[9] 高巍, 孟慶翔, 肖訓軍, 等. 生長豬胃腸道乳酸菌、雙歧桿菌和大腸桿菌的數(shù)量和分布規(guī)律[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報, 2001, 6(5): 81-86.

[10] 封莉, 黃繼超, 劉欣, 等. 食源性致病菌快速檢測技術研究進展[J].食品科學, 2012, 33(21): 332-339.

[11] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. SN/T 1869—2007 食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007.

[12] RAHN K, DEGRANDIS S A, CLARKE R C, et al. Amplifi cation of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella[J]. Molecular and Cell Probes, 1992, 6(4): 271-279.

[13] 王海艷, 劉中學, 劉虹. 食品中單增李斯特菌快速、敏感、特異PCR檢測方法的建立[J]. 檢驗檢疫科學, 2006(1): 3-6.

[14] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. SN/T 1632.2—2005 奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2005.

[15] 衛(wèi)生部, 國家標準化管理委員會. GB/T 4789.36—2008 食品衛(wèi)生微生物學檢驗: 大腸埃希氏菌O157:H7 NM檢驗[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[16] 衛(wèi)生部, 國家標準化管理委員會. GB 4789.4—2010 食品微生物學檢驗: 沙門氏菌檢驗[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[17] 衛(wèi)生部, 國家標準化管理委員會. GB 4789.40—2010 食品微生物學檢驗: 阪崎腸桿菌檢驗[S]. 中國標準出版社, 2010.

[18] 衛(wèi)生部, 國家標準化管理委員會. GB 4789.30—2010 食品微生物學檢驗: 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[S]. 中國標準出版社, 2010.

[19] 衛(wèi)生部, 國家標準化管理委員會. GB 4789.5—2012 食品微生物學檢驗: 志賀氏菌檢驗[S]. 中國標準出版社, 2012.

[20] JONG H Y, SU P T, SANPONG P, et al. PCR-based restriction fragment length polymorphism for subtyping of Salmonella from chicken isolates[J]. Kasetsart Journal (Nature and Science), 2010, 44: 79-83.

[21] 王虎虎, 徐幸蓮. 冰鮮雞肉中致病菌三重PCR檢測方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學, 2010, 53(17): 3608-3615.

[22] VALERO A, HERNANDEZ M, CESARE A D, et al. Probabilistic approach for determining Salmonella spp. and L. monocytogenes concentration in pork meat from presence/absence microbiological data[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 184: 60-63.

[23] VINOTH KUMAR R, ARUNAGIRI K, SIVAKUMAR T. Studies on pathogenic Listeria monocytogenes from marine food resources[J]. International Journal of Current Microbiology and Applied Science, 2013, 1(1): 86-93.

[24] 戴賢君, 楊宗照, 張富明. 豬肉生產(chǎn)過程中大腸桿菌O157:H7的分離、鑒定及生物學特性[J]. 中國食品學報, 2010, 10(5): 237-241.

[25] 馮瑩穎, 張強, 黃蘭紅, 等. InlA和InlB介導單核細胞增生李斯特菌入侵宿主細胞分子機制的研究進展[J]. 微生物學通報, 2009, 36(12): 1894-1900.

[26] SEVEAU S, PIZARRO C J, COSSART P. Molecular mechanisms exploited by Listeria monocytogenes during host cell invasion[J]. Microbes and Infection, 2007, 9(10): 1167-1175.

[27] SASAKI Y, HARUNA M, MURAKAMI M, et al. Contamination of poultry products with Listeria monocytogenes at poultry processing plants[J]. Public Health, 2014, 76(1): 129-132.

[28] 孫曉明, 張海妍, 張松山, 等. 市售雞肉產(chǎn)品的食源性致病微生物檢測的研究[J]. 肉類研究, 2010, 24(7): 50-53.

[29] 王歡, 金洪年, 王志耕, 等. 合肥市售冰鮮雞肉中沙門菌及微生物污染狀況調(diào)查[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010, 23(3): 720-722.

Detection of Contamination of Five Main Foodborne Pathogens and Distribution Probability Assessment in Commercial Raw Chicken

PU Chengjun1, CUI Xingbo1, DU Lanlan1, LEI Ya1, ZHANG Hongyu1, LIU Fang2, DONG Qingli1, LIU Qing1,*
(1. College of Food Science and Medical Instrument, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. International Travel Health Care Center of Gansu Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730020, China)

In order to understand the distribution patterns of pathogens in different parts of raw chicken, PCR was used to detect Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Shigella, Listeria monocytogenes and Enterobacter sakazakii that distribute on drumstick, claw, wing, breast and gizzard in 208 samples collected from 52 local markets in Shanghai. Then we established evaluation of the target point according to beta probability distribution. The results indicated that no Escherichia coli O157:H7 or Salmonella were detected in all samples, 1 strain of Enterobacter sakazakii was detected in chicken wing, 2 strains of Shigella were detected in chicken wing and gizzard, and 11 strains of Listeria monocytogenes were detected with a detection rate of 5.29%, including 4 in chicken wing, 3 in drumstick, 3 in claw and 1 in gizzard.

PCR; pathogens; raw chicken; beta probability distribution; target point evaluation

R155.5

A

1002-6630(2015)10-0201-05

10.7506/spkx1002-6630-201510040

2014-06-11

大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(XJ2013231)；上海市科委重點支撐項目(13430502400)；國家質(zhì)檢總局科技項目(GSCIQ_2010IK220)

蒲承君(1992—),女,本科,研究方向為食品微生物。E-mail：chengjunpu@hotmail.com

*通信作者：劉箐(1970—),男,教授,博士,研究方向為食源性致病菌致病機理及快速檢測技術。E-mail： liuq@usst.edu.cn