劉 棠，楊遠(yuǎn)帆，杜希萍，黃良仕，肖安風(fēng)，倪 輝,* ，F(xiàn)eng CHEN

（1.廈門出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361012；2.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.福建省平和縣農(nóng)業(yè)局，福建 漳州 363700；4.克萊姆森大學(xué)食品、營養(yǎng)與包裝科學(xué)系，美國 南卡羅萊娜 克萊姆森 29631）

柚苷酶處理、果汁濃縮和低溫貯藏對柚子果汁中檸檬苦素的影響

劉 棠1，楊遠(yuǎn)帆2，杜希萍2，黃良仕3，肖安風(fēng)2，倪 輝2,* ，F(xiàn)eng CHEN4

（1.廈門出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361012；2.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.福建省平和縣農(nóng)業(yè)局，福建 漳州 363700；4.克萊姆森大學(xué)食品、營養(yǎng)與包裝科學(xué)系，美國 南卡羅萊娜 克萊姆森 29631）

采用高效液相色譜法測定檸檬苦素含量，以柚子果汁為對象研究柚苷酶處理、果汁濃縮和低溫貯藏等工序?qū)Ω涕俟袡幟士嗨睾康挠绊?。結(jié)果表明，液相色譜方法可使檸檬苦素、普魯寧、柚皮苷和柚皮素完全分離，消除了柚皮素對檸檬苦素測定的影響；檸檬苦素檢出限為0.95 μg/mL，定量限為3.17 μg/mL，樣品回收率為102.6%～104.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.34%～1.04%。柚苷酶水解過程中的加熱及果汁濃縮和低溫貯藏等操作都能促進(jìn)檸檬苦素的從果汁中結(jié)晶析出，綜合采用柚苷酶 水解、濃縮和低溫貯藏等操作，并經(jīng)過離心分離可去除柚汁中78%的檸檬苦素，使果汁中檸檬苦素含量降低到19 ?g/mL。

高效液相色譜；柚子；果汁；檸檬苦素；柚苷酶

柚皮苷和檸檬苦素是柑橘類果汁的主要苦味物質(zhì)[1]，柚皮苷是一種黃酮類化合物，它是果汁的前苦味物質(zhì)[2]；而檸檬苦素是一類三萜系化合物，它的存在導(dǎo)致很多柑橘類果汁產(chǎn)生強烈的“后苦味”[3-4]；這些苦味物質(zhì)是限制酸橙和柚子等柑橘類水果的加工利用的最主要因素。

雖然某些樹脂和β-環(huán)糊精對柚皮苷和檸檬苦素具有很強的吸附能力，但并未廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，主要原因是它們在吸附這兩種苦味物質(zhì)的同時，也會吸附大量的營養(yǎng)成分和風(fēng)味成分[5-7]。酶法脫苦成為近年來的研究熱點。研究表明，用霉菌來源的柚苷酶可以高效地去除柑橘果汁中的柚皮苷[8-11]。此外，某些微生物可以合成具有檸檬苦素轉(zhuǎn)化作用的酶類，如檸檬苦素-D-環(huán)內(nèi)酯水解酶、檸檬苦素類化合物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和檸檬苦素脫氫酶，這些酶在堿性條件下可以將檸檬苦素轉(zhuǎn)化為無苦味的檸檬苦素糖苷和17-脫氫檸檬苦素類A-環(huán)內(nèi)酯[12-13]，但在柑橘果汁的酸性環(huán)境下則不穩(wěn)定甚至失去活性，限制了其在柑橘果汁加工中的應(yīng)用。因此，檸檬苦素的存在是用酶法脫苦生產(chǎn)酸橙和柚子果汁的主要障礙。

在前期研究中，已篩選出了能夠合成柚苷酶的菌株，而且分離純化得到了能去除柚子果汁苦味的柚苷 酶[14-18]，并已應(yīng)用于去除琯溪蜜柚果汁的柚皮苷。因此，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜法測定檸檬苦素含量變化，研究柚苷酶處理、濃縮、低溫貯藏等加工工藝對柚汁中檸檬苦素的影響，為開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的柚子果汁生產(chǎn)技術(shù)提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

琯溪蜜柚，由福建省國農(nóng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司（中國福建省平和縣產(chǎn)）提供。

柚皮苷、柚皮素、檸檬苦素和普魯寧標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司；硫酸銨及其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀（配有2487紫外檢測器、System Breeze系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)處理工作站、Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm））、Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱 美國Waters公司；Cary50型紫外分光光度計 美國Varian公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；超濾裝置（配有直徑50 mm、孔徑0.45 μm的濾膜） 天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；TDL-40B離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 柚苷酶制備

按照Chen Yuelong等[10]方法以柚皮苷為唯一碳源培養(yǎng)棘孢曲霉JMUdb058，并用硫酸銨沉淀法收集發(fā)酵產(chǎn)物中的柚苷酶，其中硫酸銨沉淀的飽和度范圍為40%～80%。所獲得的柚苷酶活力為355.0 U/mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

柚皮苷、柚皮素、檸檬苦素和普魯寧先用乙腈溶解配制成500 μg/mL的貯存溶液，—20 ℃保存?zhèn)溆?，使用時按需要用乙腈稀釋成適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度。

1.3.3 柚子汁的制備

柚子剝?nèi)ネ夤?，將果肉切碎、榨汁，將所得柚汁（可溶性固形物含量?0%）冷藏備用。

1.3.4 檸檬苦素的提取

先用2.0 mL甲醇活化Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱，再用2.0 mL去離子水平衡。將柚子果汁于4 000×g離心10 min后取1 mL上樣于Sep-Pak Plus C18微固相萃取小柱，用1 mL去離子水淋洗后用1 mL 60%乙腈溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜后備用。

1.3.5 高效液相色譜條件

色譜條件在相關(guān)文獻(xiàn)[19]的基礎(chǔ)上進(jìn)行并略作調(diào)整。進(jìn)樣量20 μL，柱溫35℃，流動相為水（A）和乙腈（B），以0.5 mL/min流速進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件：0～4 min，95% A；4～14 min，60% A；14～16 min，保持60% A；16～24 min，30% A；24～28 min，95% A；28～32 min，保持95% A；檢測波長為210 nm。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和檢出限及定量限分析

用60%乙腈將檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、150、200、250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制檸檬苦素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以3 倍信噪比所對應(yīng)的樣品溶液質(zhì)量濃度作為檢出限，10 倍信噪比所對應(yīng)的樣品溶液質(zhì)量濃度作為定量限。

1.3.7 準(zhǔn)確度和精密度

采用加標(biāo)回收率進(jìn)行方法準(zhǔn)確度的評價。以Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱處理過的柚子果汁為空白溶液，在其中定量加入檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)后溶液的檸檬苦素質(zhì)量濃度分別為30、60、90 μg/mL，測定檸檬苦素含量（n=5），計算樣品空白加標(biāo)回收率（即檢測值與理論值的百分比）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8 柚苷酶處理柚汁過程中檸檬苦素結(jié)晶析出的測定

分別以未經(jīng)處理和加熱處理的柚子果汁為對照，比較柚苷酶處理對果汁中檸檬苦素結(jié)晶析出的影響。其中，加酶處理組是在100 mL果汁中加入5 mL柚苷酶液，50 ℃酶解60 min后，加熱到100 ℃，保持15 mL滅酶；加熱處理組是在100 mL果汁中加入5 mL經(jīng)過滅活的柚苷酶液，其他條件同加酶處理組。每隔10 min取樣，4 000×g離心10 min去除結(jié)晶沉淀中的檸檬苦素，測定果汁上清液中的檸檬苦素含量。

1.3.9 果汁濃縮和低溫貯藏對檸檬苦素的影響

在50 ℃條件下對未經(jīng)處理和經(jīng)加酶處理的柚子汁進(jìn)行真空濃縮，濃縮至可溶性固形物含量達(dá)到20%，將濃縮前后的果汁置于4 ℃和—20 ℃環(huán)境下，存放12 d，每4 d取樣1 次，離心去除沉淀后測定上清液中的檸檬苦素含量，將測得的檸檬苦素含量除以2，折算成與未濃縮果汁相同體積中所含有的檸檬苦素含量，以未濃縮的果汁為對照，對比分析濃縮處理及貯藏條件對檸檬苦素含量的影響。

1.3.10 柚苷酶處理、濃縮和低溫貯藏等工序?qū)θコ龣幟士嗨睾康呢暙I(xiàn)率分析

以柚子果汁為原料，依次進(jìn)行柚苷酶處理、真空濃縮（至可溶性固形物含量達(dá)到20%）、4 ℃貯藏4 d，取樣離心后測定每個階段的檸檬苦素含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗平行3 次，應(yīng)用SPSS 17.0軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并對結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚子果汁中檸檬苦素的測定方法的建立及評價

由圖1可見，采用的液相色譜方法可實現(xiàn)柚皮苷、普魯寧、柚皮素和檸檬苦素的完全分離，保留時間分別為14.5、14.9、19.1 min和22.7 min，各峰形對稱而尖銳，相互間的分離度均大于1.5，說明這4 種物質(zhì)達(dá)到了完全分離。按1.3.6節(jié)方法，計算得檸檬苦素回歸方程為y=29 225x+8 350，R2值為1。這是說明檸檬苦素在質(zhì)量濃度6.25～250 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性。根據(jù)基線的噪聲，按照1.3.6節(jié)的方法計算得到檸檬苦素的檢出限和定量限分別是0.95 μg/mL和3.17 μg/mL。按照1.3.7節(jié)方法測定回收率和精密度，結(jié)果（表1）表明，檸檬苦素在低、中、高3 個添加水平下的回收率介于102.6%～104.2%之間，說明其檢測值可代表實際理論值；用3 個不同添加水平下分別進(jìn)行5 次平行實驗，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.34%～1.04%之間，均小于5%，說明該方法具有較好的重復(fù)性。目前已報道了一些檢測柑橘果汁中的柚皮苷、柚皮素和檸檬苦素的高效液相色譜方法[10,20-21]，但忽略了柚皮苷和柚皮素對檸檬苦素測定的影響。當(dāng)用柚苷酶對柑橘果汁進(jìn)行脫苦時，柚皮苷被水解生成柚皮素[21]。由于柚皮素與檸檬苦素的極性較相近，且在檢測檸檬苦素的波長處（210 nm）也具有強吸收（圖1），因此，可能影響檸檬苦素測定。本研究采用高效液相色譜方法實現(xiàn)了柚皮素和檸檬苦素的完全分離，并且具有良好的定量限、回收率和精密度，因此，可以精確測定經(jīng)柚苷酶處理的柑橘果汁中的檸檬苦素含量。

2.2 柚苷酶處理對柚汁中檸檬苦素的影響

圖2 表明，隨著柚苷酶處理時間的延長，果汁上清液中檸檬苦素含量呈現(xiàn)下降趨勢，前20 min內(nèi)下降明顯；處理20 min時，檸檬苦素去除率達(dá)到27.0%，隨后下降趨勢平緩，去除率趨于穩(wěn)定，柚苷酶處理至60 min時，檸檬苦素去除率為33.6%。此外，在沉淀中檢測到大量的檸檬苦素。圖3表明，以滅活的酶液代替柚苷酶液對果汁進(jìn)行處理（保溫及加熱），二者上清液中檸檬苦素含量相當(dāng)，這說明引起柚子果汁上清液中檸檬苦素減少的原因是加熱處理，而不是柚苷酶水解作用，該結(jié)果與鄔應(yīng)龍等[22]

研究結(jié)果相一致。相關(guān)文獻(xiàn)表明，在水中檸檬苦素的溶解度僅5 μg/mL，但在柚子和其他柑橘果汁中檸檬苦素的溶解度更高，主要是因為果膠將檸檬苦素包裹在其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中形成穩(wěn)定的膠體結(jié)構(gòu)[23-24]。當(dāng)果汁受熱時，果膠溶液的黏度會降低，檸檬苦素分子碰撞聚合的機率增大，導(dǎo)致檸檬苦素結(jié)晶析出，這可能是柚苷酶處理后果汁上清液中檸檬苦素質(zhì)量濃度降低主要原因。

2.3 濃縮及低溫貯藏對柚汁中檸檬苦素的影響

由圖4可以看出，4 種果汁中的檸檬苦素含量隨著放置時間的延長，整體呈下降趨勢，且均在4 d后趨于平緩；同時，圖4還表明，檸檬苦素在—20 ℃和4 ℃貯藏條件下，溶解度無顯著差異，所以兩種貯藏溫度條件下檸檬苦素含量的變化情況也基本一致；比較濃縮前后果汁中檸檬苦素含量可知，經(jīng)濃縮處理后果汁中檸檬苦素含量明顯降低。上述研究結(jié)果表明，柚苷酶處理過程中的加熱、濃縮、低溫貯藏（4 ℃）等工序均可促進(jìn)琯溪蜜柚果汁中檸檬苦素含量的降低。

由圖5可以看出，柚子果汁經(jīng)柚苷酶處理、濃縮、4 ℃貯藏4 d后，經(jīng)離心后其檸檬苦素含量分別下降了30%、17%、31%，總?cè)コ蔬_(dá)到78%，經(jīng)以上處理后，濃縮柚汁折算成與未濃縮果汁相同體積含有的檸檬苦素含量為19 ?g/mL。相關(guān)研究表明，檸檬苦素在飲料中的苦味閾值為10～14 ?g/mL[25]。以此為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過柚苷酶水解處理、濃縮、冷藏制備得到的濃縮果汁即使用于生產(chǎn)果汁含量高于50%的果汁飲料，其檸檬苦素的含量也低于其苦味閾值。此外，前期研究表明，經(jīng)過柚苷酶處理后，琯溪蜜柚中柚皮苷的含量可去除90%以上，即使用于生產(chǎn)果汁含量100%的飲料產(chǎn)品，柚皮苷的含量也低于其苦味閾值[11]。因此，本研究表明，在柑橘類果汁加工過程中，可以綜合運用酶處理、濃縮、低溫貯藏而同時去除柚皮苷和檸檬苦素的苦味。

3 結(jié) 論

本實驗建立了一種準(zhǔn)確測定柑橘類果汁中檸檬苦素的高效液相色譜方法，并發(fā)現(xiàn)加熱、濃縮和低溫貯藏等操作能促進(jìn)柚子果汁中檸檬苦素的結(jié)晶析出。柚子果汁經(jīng)過柚苷酶水解、濃縮并在4 ℃貯藏4 d后，經(jīng)過離心分離沉淀，果汁的檸檬苦素去除率可達(dá)到78%，濃縮柚汁中殘留的檸檬苦素在加工成果汁（19 ?g/mL）飲料后不會引起苦味。因此，該研究可為柑橘類果汁加工及開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

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Effects of Naringinase Treatment, Juice Condensation and Low-Temperature Storage on Limonin in Pummelo Juice

LIU Tang1, YANG Yuanfan2, DU Xiping2, HUANG Liangshi3, XIAO Anfeng2, NI Hui2,*, Feng CHEN4
(1. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Brueau, Xiamen 361012, China; 2. Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering, College of Food Science and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 3. Fujian Provincial Agriculture Bureau of Pinghe County, Zhangzhou 363700, China; 4. Department of Food, Nutrition and Packaging Sciences, Clemson University, Clemson SC 29631, USA)

Naringin and limonin are the major compounds responsible for the bitter taste of citrus juice. Although naringin could be effectively transformed to a nonbitter chemical by naringinase, limonin is hard to be removed from citrus juice. Naringenin is the hydrolysis product of naringin, and always disturb the determination of limonin in case of HPLC analysis due to similar polarity and overlapped absorbance spectra with naringin. In order to develop the juice processing and debittering process on the basis of naringinase treatment, a high performance liquid chromatography (HPLC) procedure was established and used to study the effects of naringinase treatment, condensation and low-temperature storage on limonin in pummelo juice. The results showed that the HPLC method achieved complete separation of limonin from naringin, prunin and naringenin, which protected correct determination of limonin by removing the disturbance from naringenin. The limit of detection, limit of quantification, recoveries and relative standard deviations (RSDs) were 0.95, 3.17 μg/mL, 102.6%–104.2% and 0.34%–1.04% for limonin, respectively. Moreover, heat treatment, concentration and storage at low temperatures could promote crystallization and make it easy to eliminate limonin from pummelo juice. By using a combined process consisting of naringinase treatment, condensation, storage at low temperature and centrifugation of limonin crystal, 78% of the limonin was removed from the juice, thus resulting in a pummelo juice containing 19 ?g/mL of limonin.

high performance liquid chromatography (HPLC); pummelo; juice; limonin; naringinase

TS255

A

1002-6630（2015）04-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201504001

2014-05-20

國家自然科學(xué)基金面上項目（31271914）；廈門市杰出青年科學(xué)基金項目（3502Z20126008）；集美大學(xué)科研創(chuàng)新團隊基金項目（2010A006）

劉棠（1980—），男，工程師，碩士，主要從事食品分析與檢測研究。E-mail：203008@qq.com

*通信作者：倪輝（1973—），男，教授，博士，主要從事食品酶學(xué)和食品發(fā)酵研究。E-mail：nihui@jmu.edu.cn