張志勇,潘 妍,趙 艷,任牡丹,李雅睿,盧桂芳,和水祥(西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 7006;空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化病醫(yī)院;共同第一作者;通訊作者,E-mail:dyyyjxk@mail.xjtu.edu.cn)

胃癌是全球第五大最常見的癌癥,也是導致癌癥死亡的第三大原因。近年來,胃癌發(fā)病率顯著上升[1,2]。盡管胃癌的綜合治療取得了進展,但胃癌患者的5年生存率仍然不高[3]。胃癌患者治療失敗的主要原因是化療耐藥。順鉑(cisplatin,DDP)是治療胃癌的一線藥物。然而,DDP耐藥現(xiàn)象普遍存在,正成為影響胃癌預后的關鍵因素。因此,研究DDP耐藥的分子機制對胃癌的治療具有重要意義。DNA修復是一系列因染色體完整性受損而發(fā)生的分子變化。在染色體DNA中誘導DNA損傷是放療和化療等癌癥治療的主要機制之一[4]。DNA修復通路的激活和表達水平在很大程度上決定了化療的療效[5]。檸檬苦素(limonin)是一種來源于柑橘屬植物果實中的三萜類化合物,分子式:C26H30O8,分子量:470.512。多項研究報道,檸檬苦素具有抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗蟲、抗氧化、保肝、神經(jīng)保護、抗骨質疏松、抗肥胖、抗過敏等藥理活性[6]。檸檬苦素的抗癌活性日益收到廣大學者的關注。最近的研究顯示,檸檬苦素通過抑制STAT3的活化預防并抑制胃癌細胞的轉移[7]。然而,目前尚不清楚檸檬苦素是否可增強胃癌細胞對DDP的敏感性。因此,本研究探討了檸檬苦素對胃癌細胞化療敏感性及DNA損傷修復的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SGC-7901細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素。

1.2.2 DDP耐藥的SGC-7901細胞株構建 參考文獻[8]所述方法,用0.5 μmol/L的DDP處理SGC-7901細胞48 h,然后更換為正常培養(yǎng)基,當細胞達到90%匯合時,重復上述操作直至細胞能在含0.5 μmol/L的DDP的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。然后逐漸提高DDP濃度(0.5,1,1.5,2,2.5,3 μmol/L)并用相同的培養(yǎng)方法培養(yǎng),直至細胞能在含3 μmol/L的DDP的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長,即得SGC-7901/DDP耐藥株。然后將SGC-7901/DDP細胞在含3 μmol/L的DDP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞存活率測定 用MTT法測定細胞存活率。將SGC-7901/DDP細胞(1×104個/孔)在96孔板中培養(yǎng)24 h,然后更換為含1% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別將細胞用不同濃度(0,5,10,20,40,80,160 μmol/L)的檸檬苦素處理48 h,或不同濃度(0,4,8,16,32,64 μmol/L)的DDP處理48 h。處理后將細胞與MTT試劑(0.5 mg/ml)孵育4 h,然后加入150 ml二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臜。在490 nm波長處測定吸光度。細胞存活率計算如下:細胞存活率(%)=樣本A490/對照A490×100%。實驗至少重復3次。用Graph Pad Prism 5計算IC50值。

1.2.4 細胞分組及處理 將細胞分為4組:對照組、檸檬苦素組、DDP組和檸檬苦素+DDP組。檸檬苦素的濃度為40 μmol/L,DDP的濃度為16 μmol/L。對照組細胞正常培養(yǎng),檸檬苦素組細胞用含40 μmol/L檸檬苦素的培養(yǎng)基培養(yǎng),DDP組細胞用含16 μmol/L DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng),檸檬苦素+DDP組細胞用含40 μmol/L檸檬苦素和16 μmol/L DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)上述MTT法測定各組的存活率。

1.2.5 集落形成實驗檢測細胞增殖 SGC-7901/DDP細胞以1 000個/孔的密度接種于6孔板。接種24 h后,用檸檬苦素或DDP處理48 h,更換為不含藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d,每隔2 d更換培養(yǎng)基。然后將細胞用甲醇固定并用結晶紫染色。在顯微鏡下計數(shù)含有50個細胞以上的集落。實驗至少重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取2 ml SGC-7901/DDP細胞(1×106/ml)接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后更換為含1% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)。然后將細胞用檸檬苦素或DDP處理48 h后,用PBS洗滌。然后用5 μl Annexin Ⅴ-FITC孵育15 min,1 000 r/min離心5 min后,重懸細胞并與10 μl PI室溫避光孵育30 min。用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞。實驗至少重復3次。

1.2.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved PARP1、γ-H2AX和53BP1的蛋白表達水平 SGC-7901/DDP細胞用檸檬苦素或DDP處理48 h后,收集細胞,用RIPA裂解緩沖液裂解,細胞裂解液在4 ℃ 12 000g離心10 min,收集上清液。用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。將蛋白質經(jīng)10%SDS-PAGE電泳并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶溶液封閉膜1 h,在4 ℃下分別與Bax(1 ∶2 000稀釋)、Bcl-2(1 ∶2 000稀釋)、cleaved Caspase-3(1 ∶3 000稀釋)、cleaved PARP1(1 ∶3 000稀釋)、γ-H2AX(1 ∶1 000稀釋)、53BP1(1 ∶2 000稀釋)和GAPDH(1 ∶1 000稀釋)一抗孵育過夜,然后用HRP標記的二抗(1 ∶2 000稀釋)在室溫下孵育1 h。用增強化學發(fā)光(ECL)系統(tǒng)檢測蛋白表達水平。實驗至少重復3次。

1.2.9 胃癌移植瘤裸鼠模型的構建及處理 40只4周齡雄性BALB/c-nu小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體的環(huán)境中,環(huán)境溫度(22±1)℃、相對濕度(60±5)%、光照/黑暗周期12/12 h(08:00-20:00光照)。每只小鼠左腋皮下注射200 μl SGC-7901/DDP細胞(2×106)。當腫瘤長徑達到8 mm時(大約1周后),取腫瘤大小相當?shù)?4只小鼠隨機分為4組(n=6):模型組、檸檬苦素組、DDP組和檸檬苦素+DDP組。模型組小鼠不進行治療。檸檬苦素給藥劑量為10 mg/(kg·d),DDP給藥劑量為5 mg/(kg·d),給藥體積均為0.1 ml。連續(xù)治療7 d。每隔1周測量腫瘤大小,計算公式為:體積=(長徑×短徑2)/2。治療4周后處死小鼠,分離腫瘤并拍攝圖像,統(tǒng)計4周內(nèi)的腫瘤體積變化。此外,另取24只小鼠按照同樣的方法進行分組及治療,觀察記錄每組小鼠的生存情況,然后進行Kaplan Meier生存分析。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以至少3個重復的平均值±標準差表示。使用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析,組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗。Kaplan Meier生存分析比較各組小鼠的生存率。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞增殖的影響

檸檬苦素處理48 h后,與0 μmol/L組相比,40,80和160 μmol/L處理組SGC-7901/DDP細胞存活率均顯著降低,表現(xiàn)為劑量依賴性(P<0.05,見圖1)。DDP處理48 h后,與0 μmol/L組相比,16,32和64 μmol/L處理組SGC-7901/DDP細胞存活率均顯著降低,表現(xiàn)為劑量依賴性(P<0.05,見圖1)。檸檬苦素和DDP處理SGC-7901/DDP細胞48 h的IC50分別為78.54 μmol/L和44.73 μmol/L。檸檬苦素或DDP處理48 h后,與對照組相比,檸檬苦素組和DDP組細胞存活率均降低(P<0.05)；與檸檬苦素組和DDP組相比,檸檬苦素+DDP組細胞存活率降低(P<0.05,見圖1)。與對照組相比,檸檬苦素組和DDP組的集落數(shù)量均降低(P<0.05)；與檸檬苦素組和DDP組相比,檸檬苦素+DDP組的集落數(shù)量降低(P<0.05,見圖2)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與對照組比較,aP<0.05;與檸檬苦素組比較,bP<0.05;與DDP組比較,cP<0.05圖1 不同濃度檸檬苦素和DDP處理48 h對SGC-7901/DDP細胞存活率的影響Figure 1 The effect of different concentrations of limonin and DDP on the survival rate of SGC-7901/DDP cells after treatment for 48 h

圖2 檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞集落形成的影響Figure 2 The effect of limonin and DDP on the colony formation of SGC-7901/DDP cells

2.2 檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞凋亡的影響

與對照組相比,檸檬苦素組和DDP組細胞凋亡率均升高(P<0.05)。與檸檬苦素組和DDP組相比,檸檬苦素+DDP組細胞凋亡率升高(P<0.05,見圖3)。與對照組相比,檸檬苦素組和DDP組Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達水平均升高,Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。與檸檬苦素組和DDP組相比,檸檬苦素+DDP組Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達水平均升高,Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05,見圖4)。

圖3 檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞凋亡的影響Figure 3 The effect of limonin and DDP on the apoptosis of SGC-7901/DDP cells

與對照組比較,*P<0.05;與檸檬苦素組比較,#P<0.05;與DDP組比較,&P<0.05圖4 Western blot檢測檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞中Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白表達的影響Figure 4 The effect of limonin and DDP on the protein expression of Bax, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in SGC-7901/DDP cells by Western blot

2.3 檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞DNA損傷修復的影響

與對照組相比,檸檬苦素組和DDP組γ-H2AX陽性率均升高(P<0.05)。與檸檬苦素組和DDP組相比,檸檬苦素+DDP組γ-H2AX陽性率升高(P<0.05,見圖5)。與對照組相比,檸檬苦素組和DDP組cleaved PARP1、γ-H2AX和53BP1蛋白表達水平均升高(P<0.05)。與檸檬苦素組和DDP組相比,檸檬苦素+DDP組的cleaved PARP1、γ-H2AX和53BP1蛋白表達水平均升高(P<0.05,見圖6)。

與對照組比較,*P<0.05;與檸檬苦素組比較,#P<0.05;與DDP組比較,&P<0.05圖5 免疫熒光染色檢測檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞中γ-H2AX表達的影響Figure 5 The effect of limonin and DDP on the expression of γ-H2AX in SGC-7901/DDP cells by immunofluoresence staining

與對照組比較,*P<0.05;與檸檬苦素組比較,#P<0.05;與DDP組比較,&P<0.05圖6 Western blot檢測檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞中cleaved PARP1、γ-H2AX和53BP1蛋白表達的影響Figure 6 The effect of limonin and DDP on the expression of cleaved PARP1, γ-H2AX and 53BP1 in SGC-7901/DDP cells by Western blot

2.4 檸檬苦素和DDP對胃癌移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響

各組小鼠經(jīng)1周的藥物治療后,在第2,3,4周時,與模型組相比,檸檬苦素組和DDP組腫瘤體積均降低(P<0.05);與檸檬苦素組和DDP組相比,檸檬苦素+DDP組腫瘤體積降低(P<0.05,見圖7)。Kaplan Meier生存分析顯示,隨訪18個月內(nèi),各組小鼠的生存率存在顯著差異(P<0.05,見圖8)。模型組1只(16.67%)小鼠存活,檸檬苦素組2只(33.33%)小鼠存活,DDP組3只(50.00%)小鼠存活,檸檬苦素+DDP組4只(66.67%)小鼠存活。

圖7 檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞移植瘤裸鼠腫瘤體積的影響Figure 7 The effect of limonin and DDP on the tumor volume of nude mice with SGC-7901/DDP cell transplantation

圖8 檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞移植瘤裸鼠存活率的影響Figure 8 The effect of limonin and DDP on the survival rate of SGC-7901/DDP cell transplanted tumor in nude mice

3 討論

DDP耐藥性是限制DDP抗癌效果的主要障礙,目前,許多學者報道了天然藥物的聯(lián)合施用可提高癌細胞對化療藥物的敏感性。例如,南蛇藤提取物通過Caspase依賴性凋亡增強DDP對胃癌的敏感性[9]。小檗堿通過促進細胞凋亡和抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路改善胃癌對DDP的化療敏感性[10]。目前,大量研究報道了檸檬苦素的抗癌活性。此外,檸檬苦素還可以增強抗癌藥物對癌細胞的毒性。檸檬苦素可顯著增強阿霉素對耐藥人白血病細胞系CEM/ADR5000細胞的細胞毒作用[11]。檸檬苦素可以通過抑制Wnt/β-catenin途徑和抑制MIR216A甲基化來抑制乳腺癌細胞的干性,減輕對阿霉素耐藥乳腺癌細胞的耐藥性[12]。檸檬苦素可以通過促進轉錄共激活因子YAP(YAP)的核漿轉位來減弱宮頸癌細胞的干性,從而增強細胞對阿霉素的敏感性[13]。然而,檸檬苦素在胃癌中的應用較少,且尚不清楚是否對化療藥物抗癌效果具有增敏作用。因此,本研究建立了DDP耐藥的SGC-7901/DDP細胞株。研究顯示,不同濃度的檸檬苦素和DDP處理SGC-7901/DDP細胞48 h后,均以劑量依賴性方式降低了細胞存活率。檸檬苦素和DDP處理SGC-7901/DDP細胞48 h的IC50分別為78.54 μmol/L和44.73 μmol/L。為了考察檸檬苦素對DDP的增敏作用,本研究設置檸檬苦素的濃度為40 μmol/L,DDP的濃度為16 μmol/L。進一步的研究證實,兩種藥物聯(lián)用進一步降低了細胞存活率。劉伯霞等[7]研究顯示,檸檬苦素對胃癌細胞系增殖的抑制作用較小,而在本研究中檸檬苦素則表現(xiàn)出良好的抗胃癌細胞增殖效果,其原因可能與細胞增殖檢測方法的不同有關。本研究MTT法和集落形成實驗均取得了一致的結果。

DDP耐藥機制與細胞凋亡蛋白的異常表達有直接的關系[14,15]。本研究結果表明,檸檬苦素增強了DDP對細胞凋亡的促進作用,并升高了SGC-7901/DDP細胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表達,降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達。其他研究報道,檸檬苦素通過激活內(nèi)源性凋亡途徑、降低Bcl2/Bax轉錄速率、誘導細胞色素C釋放誘導人結腸癌(SW480)細胞線粒體介導的內(nèi)源性凋亡[16]。在HCT-15(肝癌)和SNU449(結腸癌)細胞中,檸檬苦素通過增加Bax的表達和降低Bcl-2的表達而誘導細胞凋亡[16]。因此,在胃癌中,檸檬苦素可能通過影響凋亡相關蛋白的表達來促進細胞凋亡,并且進一步增加DDP對細胞凋亡的誘導作用。

近年來,DNA損傷修復被發(fā)現(xiàn)是腫瘤耐藥的一種新的重要機制。臨床上大多數(shù)化療藥物都是通過DNA損傷誘導細胞凋亡來清除腫瘤細胞[17],相反,持續(xù)的DNA損傷可能會激活腫瘤細胞DNA的損傷修復機制,導致化療藥物的繼發(fā)性耐藥出現(xiàn),導致臨床療效大大降低。DNA堿基切除修復(BER)是DNA損傷修復的重要途徑之一[18]。大多數(shù)化療藥物,特別是DNA合成抑制劑,如烷化劑(如DDP)、堿基類似物,通過BER導致DNA損傷修復。因此,本研究探討了檸檬苦素和DDP對SGC-7901/DDP細胞DNA損傷修復相關蛋白γ-H2AX、53BP1和PARP1的影響。研究顯示,檸檬苦素和DDP均促進了SGC-7901/DDP細胞中cleaved PARP1、γ-H2AX和53BP1的蛋白表達,并且兩種藥物具有協(xié)同作用。γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂的標志,在高等真核細胞中,染色質中的DNA雙鏈斷裂迅速啟動組蛋白H2A變異體H2AX在絲氨酸139處的磷酸化,從而產(chǎn)生γ-H2AX[19]。53BP1是細胞對DNA雙鏈斷裂反應的重要調節(jié)因子,53BP1是將DNA損傷信號傳到p53及其他腫瘤抑制蛋白途徑中的一個重要傳感器,與基因組穩(wěn)定性密切相關[20]。PARP1參與DNA損傷修復,活化的PARP-1可吸引多種DNA損傷修復因子促進DNA修復[21]。裂解的(cleaved)PARP1也是一種細胞凋亡標記物[22]。另外,PARP1抑制劑的研發(fā)已經(jīng)在抗腫瘤領域取得良好效果[23]。綜合上述報道可知,檸檬苦素具有抑制胃癌DDP耐藥細胞中DNA損傷修復的作用,并且通過這種作用提高了DDP對胃癌耐藥細胞的敏感性。本研究體內(nèi)胃癌移植瘤小鼠模型也證實了檸檬苦素聯(lián)合DDP對SGC-7901/DDP細胞移植瘤具有協(xié)同抑制作用,可明顯延長小鼠的生存期。

綜上所述,本研究表明檸檬苦素通過抑制DNA損傷修復來增強胃癌細胞的化療耐藥性。因此,檸檬苦素有望成為一種候選的化療輔助藥物。