蘭 婷,賈 如(西北婦女兒童醫(yī)院口腔科,西安 7006;西安交通大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科;通訊作者,E-mail:jiaru987@mail.xjtu.edu.cn)

牙周炎涉及牙齒周圍支持的結(jié)締組織和牙槽骨的喪失,是一種多因素的慢性感染性疾病[1]。牙周膜是一種多功能的軟結(jié)締組織,在牙周組織的動(dòng)態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用[2]。牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells, PDL)由不同功能特征的異質(zhì)成纖維細(xì)胞群組成[3]。在各種外刺激的作用下,PDL細(xì)胞最終產(chǎn)生更多的分化細(xì)胞,這些細(xì)胞可以合成鄰近的骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)[4]。ECM包含Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白[5]。文獻(xiàn)表明,Ⅰ型膠原蛋白是牙周細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,對(duì)成骨的誘導(dǎo)和動(dòng)態(tài)平衡必不可少[6]。纖維連接蛋白是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白,能夠與膠原蛋白結(jié)合,通過促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移并在傷口修復(fù)中發(fā)揮重要作用[7]。因此,外源性Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白可能調(diào)節(jié)Rho信號(hào),從而促進(jìn)PDL細(xì)胞的分化。文獻(xiàn)表明,PDL細(xì)胞具有多種成骨特性,如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的基因表達(dá),以及形成礦化結(jié)節(jié)的能力[8]。

哺乳動(dòng)物Rho鳥苷三磷酸酶(Rho GTPase)是細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,影響許多細(xì)胞過程,包括形態(tài)發(fā)生、極性、遷移和細(xì)胞分裂[9]。Rho蛋白激酶(Rho protein kinase, ROCK)參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架組織[10]。有研究表明,ROCK在誘導(dǎo)PDL細(xì)胞成骨分化中具有重要作用[11]。鹽酸土根堿(emetine dihydrochloride, EmD)是一種從吐根根部提取的主要生物堿,在臨床上被用作催吐以及抗原生動(dòng)物的主要治療藥物,可顯著抑制ALP活性、基質(zhì)礦化和Rho蛋白激酶(ROCK1和ROCK2)的活性[12]。然而,Rho通過改變ECM基因表達(dá)誘導(dǎo)PDL細(xì)胞分化的機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探究ROCK抑制劑EmD在體外ECM介導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖、遷移、愈合和成骨分化過程中可能的作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、成骨分化培養(yǎng)基、谷氨酰胺和青霉素抗生素購(gòu)于Gibco公司(美國(guó));EmD購(gòu)于MedChemExpress公司(美國(guó));胎牛血清購(gòu)于Thermo公司(美國(guó));Ⅱ型分散酶購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司;Ⅰ型膠原酶購(gòu)于Invitrogen公司(美國(guó));MTS分析試劑盒購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;96孔板、24孔板、6孔板和10 cm培養(yǎng)皿購(gòu)于Corning公司(美國(guó));Lab Assay ALP試劑盒購(gòu)于Whatman(沃特曼)公司(英國(guó));RIPA裂解緩沖液購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司公司;Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)科研;RNease Mini試劑盒購(gòu)于QIAGEN公司(德國(guó));SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)于Thermo公司(美國(guó));Ⅰ型膠原蛋白前體、纖連蛋白、堿性磷酸酶和絲狀肌動(dòng)蛋白一抗和二抗IgG購(gòu)于Abcam公司(英國(guó));化學(xué)發(fā)光底物(ECL)購(gòu)于Thermo公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 牙周膜樣本取自2019年1月至2019年6月間西北婦女兒童醫(yī)院口腔科收治的5名牙周組織健康的提供者。將取得的健康牙周組織在2 mg/ml Ⅱ型分散酶和4 mg/ml Ⅰ型膠原酶的溶液中進(jìn)行消化,并在37 ℃下放置1 h。取消化后的溶液,制備成PDL單細(xì)胞懸液(在10 cm培養(yǎng)皿中為1×104個(gè)),并于α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(補(bǔ)充20%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺和100 U/ml青霉素抗生素)。當(dāng)需要檢測(cè)PDL細(xì)胞成骨分化能力時(shí),則將α-MEM培養(yǎng)基換為成骨分化培養(yǎng)基。為了研究不同組分對(duì)PDL細(xì)胞的影響,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),將細(xì)胞分為4組:PDL組,無ECM包被的PDL細(xì)胞培養(yǎng)于不含EmD的培養(yǎng)基;PDL+ECM組,有ECM包被的PDL細(xì)胞培養(yǎng)于不含EmD的培養(yǎng)基;PDL+ECM+EmD組,ECM包被的PDL細(xì)胞培養(yǎng)于含10 μmol/L EmD的培養(yǎng)基;PDL+EmD組,無ECM包被的PDL細(xì)胞培養(yǎng)于含10 μmol/L EmD的培養(yǎng)基。本研究均獲得每位受試者的知情同意,本項(xiàng)研究得到了西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):No.2019-1-23-1016)。

1.2.2 PDL細(xì)胞活力測(cè)定 為了檢測(cè)PDL細(xì)胞的活力,使用含有四唑化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H四唑內(nèi)鹽]的MTS分析試劑盒評(píng)估各分組中PDL細(xì)胞的活力。將PDL細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到含成骨培養(yǎng)基的96孔板中,并孵育24 h。然后使用濃度為0,1,5,10,20,50,75,100 μmol/L的EmD處理PDL細(xì)胞。孵育48 h和14 d后,根據(jù)試劑盒使用說明書進(jìn)行顯色,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.2.3 PDL細(xì)胞成骨分化及ECM介導(dǎo)的成骨分化培養(yǎng) 為了檢測(cè)PDL組和PDL+EmD組PDL細(xì)胞的成骨分化能力,將PDL細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于α-MEM培養(yǎng)基中,并培養(yǎng)至80%-90%的細(xì)胞融合,然后將培養(yǎng)基替換為成骨分化培養(yǎng)基(含50 μmol/L抗壞血酸-2-磷酸、10 nmol/L β-磷酸甘油和100 nmol/L地塞米松)繼續(xù)培養(yǎng)14 d,同時(shí)每隔2～3 d更換1次培養(yǎng)基,PDL+EmD組培養(yǎng)基加入10 μmol/L EmD。使用顯微鏡檢測(cè)PDL組和PDL+EmD組中PDL細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及礦物沉積情況。為實(shí)現(xiàn)ECM誘導(dǎo)成骨分化,將細(xì)胞接種于ECM涂層平板,其余操作同上。

1.2.4 堿性磷酸酶(ALP)的活性測(cè)定 為了檢測(cè)PDL組和PDL+EmD組PDL細(xì)胞中ALP的活性,將PDL細(xì)胞在6孔未包被或ECM包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行成骨分化培養(yǎng),PDL+EmD組培養(yǎng)基加入10 μmol/L EmD,并分別在成骨分化培養(yǎng)的第0,2,4,6,8,10,12,14天后收獲。使用RIPA裂解緩沖液提取總細(xì)胞裂解物,根據(jù)Lab Assay ALP試劑盒操作說明對(duì)ALP活性進(jìn)行定量分析,裂解物的ALP活性由對(duì)硝基苯磷酸釋放的對(duì)硝基苯酚的量確定,并使用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度。

1.2.5 實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定ALP的mRNA表達(dá)水平 為了檢測(cè)PDL組和PDL+EmD組PDL細(xì)胞中ALP的mRNA表達(dá)水平,采用實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。將PDL細(xì)胞在6孔未包被或ECM包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行成骨分化培養(yǎng),PDL+EmD組培養(yǎng)基加入10 μmol/L EmD,并分別在成骨分化培養(yǎng)的第0,2,4,6,8,10,12,14天后收獲。根據(jù)使用說明書,采用RNease Mini試劑盒,從PDL細(xì)胞中提取RNA,并進(jìn)行蛋白酶K和DNase I處理。使用由ABI 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)SuperScript Ⅲ和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進(jìn)行定量RT-PCR分析。ALP-F:5′-CCTCCTCGGAAGACACTCTG-3′,ALP-R:5′-GCAGTGAAGGGCTTCTTGTC-3′;GAPDH-F:5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,GAPDH-R:5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。相對(duì)于GAPDH mRNA的表達(dá),在歸一化后顯示ALP mRNA相對(duì)表達(dá)水平,并使用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行量化。

1.2.6 免疫熒光分析Ⅰ型膠原和纖連蛋白 為了檢測(cè)PDL組和PDL+EmD組PDL細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白和纖連蛋白的表達(dá)水平,采用免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)分析。將PDL細(xì)胞在含有成骨培養(yǎng)基的8孔室中分化培養(yǎng)14 d,PDL+EmD組培養(yǎng)基加入10 μmol/L EmD,然后在4%甲醛/磷酸鹽緩沖液中固定。隨后將樣品與一抗Ⅰ型膠原蛋白前體(Procollagen-Ⅰ,1 ∶50)、纖連蛋白(Fibronectin,1 ∶250)和絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin,1 ∶100))孵育過夜,然后使用Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗(1 ∶500)孵育1 h。使用4′,6-二基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行細(xì)胞核染色,最后使用熒光顯微鏡(Olympus)進(jìn)行觀察。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡分析Ⅰ型前膠原蛋白和纖連蛋白的表達(dá)水平 為了檢測(cè)PDL組和PDL+EmD組PDL細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白和纖連蛋白的表達(dá)水平,采用蛋白質(zhì)印跡方法進(jìn)行檢測(cè)分析。將PDL細(xì)胞先在12孔非包被板中培養(yǎng)至融合度為80%-90%,并在成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后收集細(xì)胞,PDL+EmD組培養(yǎng)基加入10 μmol/L EmD。使用RIPA裂解緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解處理,并使用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)總量,將每個(gè)樣品(30 μg)總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用5%脫脂奶粉封閉1 h,洗去非特異性吸附,然后使用一抗Ⅰ型前膠原蛋白(Procollagen-Ⅰ,1 ∶500)、纖連蛋白(Fibronectin,1 ∶1 000)、ALP(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)于4 ℃孵育過夜。然后使用TBST緩沖液清洗3次,并于室溫孵育二抗IgG(1 ∶5 000)1 h,并再次使用TBST緩沖液清洗3次。使用化學(xué)發(fā)光底物(ECL)孵育上述PVDF膜,使用ChemiDocTMMP系統(tǒng)和ImageLab軟件(Bio-Rad)檢測(cè)蛋白條帶并進(jìn)行定量分析。

1.2.8 PDL細(xì)胞增殖測(cè)定 為了檢測(cè)PDL組、PDL+EmD組、PDL+ECM+EmD和PDL+EmD組中PDL細(xì)胞增殖情況,采用MTS分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。將PDL細(xì)胞在含成骨培養(yǎng)基的96孔未包被或ECM包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)14 d。其具體方法為:將PDL細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到含成骨培養(yǎng)基的96孔未包被或ECM包被的培養(yǎng)皿中,并孵育24 h。按照分組分別使用濃度為10 μmol/L的EmD處理或不處理PDL細(xì)胞。然后孵育14 d后,根據(jù)MTS分析試劑盒使用說明書進(jìn)行顯色,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.2.9 ALP菌落陽性效率測(cè)定 為了檢測(cè)PDL組、PDL+EmD組、PDL+ECM+EmD和PDL+EmD組中PDL細(xì)胞增殖情況,使用ALP活性分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。將PDL細(xì)胞以1×103個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種在含成骨培養(yǎng)基的6孔未包被或ECM包被的培養(yǎng)皿中,按照分組要求用0,10 μmol/L的EmD處理PDL細(xì)胞。14 d后,將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定30 min。然后用結(jié)晶紫染色5 min后,使用照相機(jī)及顯微鏡對(duì)細(xì)胞菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)并評(píng)估菌落形成能力。

1.2.10 PDL細(xì)胞遷移和愈合能力測(cè)定 為了檢測(cè)PDL組、PDL+EmD組、PDL+ECM+EmD和PDL+EmD組中PDL細(xì)胞遷移和愈合能力,使Transwell和傷口愈合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。在24孔未包被或ECM包被的孔徑為8 μmol/L的聚碳酸酯膜的Transwell腔室中評(píng)估EmD對(duì)PDL細(xì)胞遷移的能力。于上腔室中加入200 μl含1×105個(gè)細(xì)胞的0.1% FBS的DMEM培養(yǎng)基,在下腔室中加入500 μl含0,10 μmol/L EmD的0.1% FBS的DMEM中。于37 ℃孵育20 h,除去膜上層未遷移細(xì)胞后,將已遷移通過膜的細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中,用0.1%結(jié)晶紫染色,并于顯微鏡中觀察和計(jì)數(shù)。

在傷口愈合試驗(yàn)中,將PDL細(xì)胞接種在未包被或ECM包被的培養(yǎng)皿中上,培養(yǎng)至融合度為90%。在血清饑餓24 h后,使用無菌移液管吸頭刮擦單層。然后將含有0或10 μmol/L EmD和0.1% FBS的培養(yǎng)基加入到每個(gè)平板中。使用顯微鏡(Olympus)于0 h和12 h在相同位置拍攝細(xì)胞遷移的距離,使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量和計(jì)算細(xì)胞遷移的距離。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 ROCK抑制劑EmD對(duì)PDL細(xì)胞活力的影響

MTS檢測(cè)ROCK抑制劑EmD對(duì)PDL細(xì)胞活力的結(jié)果表明,當(dāng)EmD的使用濃度為0-10 μmol/L,培養(yǎng)48 h后PDL細(xì)胞的活力基本不受影響;當(dāng)EmD的使用濃度超過10 μmol/L,PDL細(xì)胞的活力開始降低,當(dāng)濃度超過50 μmol/L時(shí),PDL細(xì)胞活性受到顯著抑制(P<0.05,見圖1)。使用10 μmol/L EmD培養(yǎng)PDL細(xì)胞14 d后,PDL細(xì)胞活力穩(wěn)定,這表明10 μmol/L的EmD對(duì)PDL細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期處理不會(huì)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著影響。

A.MTS定量分析不同EmD濃度處理48 h后對(duì)細(xì)胞活力的影響 B.MTS定量分析不同EmD濃度處理14 d后細(xì)胞活力的影響與0 μmol/L EmD相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 EmD對(duì)PDL細(xì)胞活力的影響Figure 1 The effect of EmD on the viability of PDL cells

2.2 ROCK抑制劑EmD對(duì)PDL細(xì)胞中堿性磷酸酶表達(dá)水平和活性的影響

ALP的表達(dá)水平和活性檢測(cè)結(jié)果顯示,從第8天開始,與PDL組相比,PDL+EmD組細(xì)胞中ALP的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);從第10天開始,與PDL組相比,PDL+EmD組細(xì)胞中ALP的活性顯著下降(P<0.01,見圖2)。成骨細(xì)胞分化結(jié)果表明,PDL組中PDL細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的礦化作用;與PDL組相比,PDL+EmD組PDL細(xì)胞分化降低,礦化作用仍保持較低水平。這表明在PDL細(xì)胞的成骨分化過程中,ROCK抑制劑EmD部分抑制了ALP活性(見圖3)。

與PDL組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖2 EmD顯著抑制ALP的表達(dá)和活性Figure 2 EmD significantly inhibited the expression and activity of ALP

圖3 EmD對(duì)PDL細(xì)胞成骨分化過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Figure 3 Effects of EmD on the morphology of PDL cells during osteogenic differentiation

2.3 ROCK抑制劑EmD對(duì)PDL細(xì)胞中Ⅰ型膠原和纖連蛋白表達(dá)水平的影響

免疫熒光分析結(jié)果表明,PDL組中PDL細(xì)胞以高密度多層生長(zhǎng);與PDL組相比,PDL+EmD組出現(xiàn)更細(xì)的肌動(dòng)蛋白絲。Ⅰ型膠原蛋白前體染色結(jié)果顯示,PDL組纖連蛋白位于細(xì)胞表面、核周區(qū)域和細(xì)胞外空間;與PDL組相比,PDL+EmD組Procollagen-Ⅰ和Fibronectin蛋白的免疫反應(yīng)性顯著減弱。Western blotting分析結(jié)果顯示,與PDL組相比,PDL+EmD組的Procollagen-Ⅰ和Fibronectin蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),ALP蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖4和圖5)。

與PDL組相比,*P<0.05,**P<0.01圖5 Western blotting分析檢測(cè)Procollagen-Ⅰ、Fibronectin和ALP的蛋白表達(dá)水平Figure5 The protein expression levels of Procollagen-Ⅰ, Fibronectin and ALP detected by Western blotting

2.4 ROCK抑制劑EmD對(duì)ECM介導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖的影響

將原代培養(yǎng)的PDL細(xì)胞的單細(xì)胞懸液培養(yǎng)21 d后,與PDL組相比,PDL+ECM組PDL細(xì)胞增殖活力均顯著升高(P<0.05),PDL+EmD組ALP陽性菌落的出現(xiàn)率和PDL細(xì)胞增殖活力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與PDL+ECM相比,PDL+ECM+EmD組ALP陽性菌落的出現(xiàn)率和PDL細(xì)胞增殖活力均顯著降低(P<0.05,見圖6)。這些結(jié)果表明,ECM(膠原蛋白Ⅰ和纖連蛋白)外源刺激加速了細(xì)胞增殖,而EmD有效地降低了ECM介導(dǎo)的PDL細(xì)胞中ALP活性,從而抑制ECM介導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖。

A.原代培養(yǎng)PDL細(xì)胞的單細(xì)胞懸液ALP陽性菌落分析 B.MTS分析PDL細(xì)胞增殖情況與PDL組相比,*P<0.05;與PDL+ECM組相比,#P<0.05圖6 PDL增殖及ALP陽性菌落分析Figure 6 Analysis of cell proliferation and ALP positive colonies

2.5 ROCK抑制劑EmD對(duì)ECM介導(dǎo)的PDL細(xì)胞遷移和愈合能力的影響

與PDL組相比,PDL+ECM組PDL細(xì)胞遷移和愈合能力顯著升高(P<0.01),PDL+EmD組PDL細(xì)胞遷移和愈合能力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與PDL+ECM組相比,PDL+ECM+EmD組的PDL細(xì)胞遷移和愈合能力顯著降低(P<0.01,見圖7)。

與PDL組相比,**P<0.01;與PDL+ECM組相比,##P<0.01圖7 EmD對(duì)PDL細(xì)胞遷移及愈合能力影響Figure 7 Influence of EmD on the migration and healing abilities of PDL cells

2.6 ROCK抑制劑EmD對(duì)ECM介導(dǎo)的PDL細(xì)胞成骨分化的影響

與PDL組相比,PDL+ECM組細(xì)胞的ALP活性顯著升高(P<0.01),PDL+EmD組細(xì)胞的ALP活性顯著降低(P<0.01);與PDL+ECM組相比,PDL+ECM+EmD組細(xì)胞的ALP活性顯著降低(P<0.01,見圖8)。該結(jié)果表明EmD顯著抑制ECM介導(dǎo)的成骨分化。

與PDL組相比,***P<0.001;與PDL+ECM組相比,###P<0.001圖8 EmD對(duì)ECM介導(dǎo)的成骨分化的影響Figure 8 Effect of EmD on ECM-mediated osteogenic differentiation

3 討論

文獻(xiàn)表明,可溶性和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分子可調(diào)節(jié)PDL細(xì)胞的分化[13]。為了了解PDL細(xì)胞成骨分化是否需要ROCK激活,本研究使用ROCK抑制劑EmD進(jìn)行了抑制試驗(yàn),以消除ROCK的活性。MTS分析結(jié)果表明,低濃度的EmD處理可維持PDL細(xì)胞的正常增殖,而高濃度的EmD則明顯抑制PDL細(xì)胞的增殖和活力。當(dāng)使用10 μmol/L的EmD處理時(shí),即使連續(xù)培養(yǎng)14 d,也不影響PDL細(xì)胞的活力,這說明使用該濃度對(duì)PDL的細(xì)胞活力并不影響。

另外,文獻(xiàn)表明,PDL細(xì)胞具有成骨特性[14]。在本研究中,通過檢測(cè)早期成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶表達(dá),以監(jiān)測(cè)PDL細(xì)胞的分化進(jìn)程。堿性磷酸酶的表達(dá)在第14天達(dá)到高峰,而PDL+EmD組細(xì)胞中堿性磷酸酶的表達(dá)水平、堿性磷酸酶的活性和礦化水平均受到顯著抑制。盡管EmD處理后堿性磷酸酶蛋白水平和堿性磷酸酶活性變化之間的差異的原因尚不清楚,但研究表明,堿性磷酸酶活性的降低與PDL細(xì)胞中鈣沉積的減少有關(guān)[15]。這些結(jié)果間接表明,ROCK抑制劑EmD抑制了PDL細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的穩(wěn)定,抑制了PDL細(xì)胞成骨的啟動(dòng)和進(jìn)展。

研究表明,成骨細(xì)胞在分化和表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)基因之前,通常優(yōu)先表達(dá)ECM成分的編碼基因,如編碼膠原和纖維連接蛋白的基因[16]。文獻(xiàn)表明,PDL細(xì)胞的成骨分化涉及ECM成分基因表達(dá)的改變[17]。ECM除了提供結(jié)構(gòu)性支持外[18],還有許多作用;如ECM是細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分,與各種細(xì)胞外刺激(如生長(zhǎng)因子和激素)在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化方面起著至關(guān)重要的作用[19]。據(jù)報(bào)道,細(xì)胞通過整合素與ECM黏附,激活引導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞間信號(hào)通路[20]。而ECM成熟需要ECM微環(huán)境協(xié)同促進(jìn)分化及伴隨ALP表達(dá)的增加[21]。ECM增加Rho/ROCK信號(hào)依賴的成骨轉(zhuǎn)錄因子Rho/ROCK的表達(dá)水平,這種轉(zhuǎn)錄因子稱為矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2,并可以調(diào)節(jié)ALP啟動(dòng)子的活性[22]。因此,我們推測(cè)ROCK抑制劑EmD下調(diào)了ECM相關(guān)基因的表達(dá)水平,從而間接降低了ALP的表達(dá)水平。本研究表明,ROCK抑制劑EmD抑制了PDL細(xì)胞中Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的蛋白表達(dá)水平,同時(shí)肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維形成顯著減少。免疫熒光分析結(jié)果表明,ROCK抑制劑EmD顯著減弱了Ⅰ型膠原蛋白前體和纖連蛋白的免疫反應(yīng)性。這些結(jié)果間接表明,ROCK抑制劑抑制了ECM連接的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排和PDL細(xì)胞的成骨分化水平。

牙周膜由處于不同分化階段的不同細(xì)胞群組成[23]。文獻(xiàn)表明,連續(xù)酶消化分離的PDL細(xì)胞表現(xiàn)出不同的增殖、堿性磷酸酶和礦化活性[24]。另外,在體內(nèi)ALP活性和Ⅰ型膠原表達(dá)在鄰近骨骼的PDL中表現(xiàn)最強(qiáng),而在鄰近骨骼的PDL中細(xì)胞增殖不顯著[25]。文獻(xiàn)表明,ECM和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有助于調(diào)節(jié)Rho活性[26]。這些數(shù)據(jù)清楚地表明,ROCK信號(hào)通過協(xié)同增加PDL細(xì)胞中Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白水平來調(diào)節(jié)成骨分化。

細(xì)胞通過整合素與ECM黏附,有助于細(xì)胞外刺激在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架內(nèi)的傳遞,并誘導(dǎo)成骨分化[27]。整合素介導(dǎo)的細(xì)胞與ECM的黏附也提供了細(xì)胞增殖所必需的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[28]。本研究結(jié)果表明,ECM外源刺激加速了細(xì)胞增殖,而ROCK抑制劑EmD有效地降低了ALP活性,從而抑制ECM介導(dǎo)的細(xì)胞增殖。細(xì)胞遷移和愈合能力結(jié)果顯示,ECM外源刺激加速了細(xì)胞遷移和愈合能力,而ROCK抑制劑EmD有效地抑制了ECM介導(dǎo)的細(xì)胞遷移和愈合能力。

綜上所述,本研究表明,在成骨分化過程中,ROCK在PDL細(xì)胞的ECM微環(huán)境中起著核心作用。ROCK抑制劑EmD可以減弱骨誘導(dǎo)反應(yīng),如堿性磷酸酶活性、F-肌動(dòng)蛋白聚合和ECM(Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白)的表達(dá)。因此,ROCK信號(hào)是控制PDL細(xì)胞和ECM之間動(dòng)態(tài)界面的重要介質(zhì),在成骨分化過程中調(diào)節(jié)由內(nèi)而外和由外而內(nèi)的信號(hào)。牙周ECM可能通過依賴于ROCK并影響ECM基因表達(dá)的機(jī)制來介導(dǎo)PDL細(xì)胞的成骨分化,并保證細(xì)胞正常的增殖及愈合。