張 丹,黃 晉,趙 倩,馮 云,劉亞萍,任牡丹,盧桂芳,盧新蘭,趙 艷,和水祥(西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內科,西安 7006;陜西科技大學電智學院;通訊作者,E-mail:dyyyjxk@xjtu.edu.cn)

胃癌的發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中均居于比較高的位置,是嚴重影響人民健康的疾病之一[1]。對胃癌發(fā)病機制進行探討,尋找能夠與胃癌發(fā)生發(fā)展相關的因子,對提高胃癌的診斷與治療有著重大的意義。睫狀神經營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)因其生理功能被歸屬于神經營養(yǎng)因子家族成員。近年來發(fā)現(xiàn)多種神經營養(yǎng)因子與非神經系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[2]。CNTF也被證實是骨髓瘤、肝癌的相關因子[3,4]。CNTF因蛋白結構特征也屬于白介素-6(interleukin-6,IL-6)家族,可以激活多條IL-6家族下游通路,包括JAK/STAT3、Ras/MAKP以及PI3K/AKT等[5]。這些通路是經典的腫瘤相關通路,參與包括胃癌在內多種腫瘤形成過程以及侵襲轉移行為[6-8]。IL-6家族其他成員包括IL-6、IL-11、白血病抑制因子也被證實與胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[9-11]。綜上,有理由推測CNTF可能與胃癌發(fā)生發(fā)展相關,本研究使用免疫組化法檢測CNTF在胃癌及其形成過程中的表達,并評估表達與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 資料來源

胃癌及癌旁組織選自2011年8月至2012年11月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院經手術切除病理確診胃癌患者共140例。其中男性103例,女性37例,中位年齡65歲。收集患者的相關一般信息及臨床病理信息,包括性別、發(fā)病年齡、病史、腫瘤部位、分級分型、相關治療、復發(fā)轉移、死亡情況等。納入標準:孩首次診治,未經化療、放療或其他腫瘤相關生物學治療處理;虎標本組織學分類、腫瘤分期明確;虎患者或其委托人知情同意;虎術后依照指南行規(guī)范化治療。排除標準:孩曾行腫瘤相關放化療、免疫治療;虎有嚴重心、肺、肝、腎等重要臟器功能不全者;虎不配合規(guī)范化治療、隨訪者。

病變胃黏膜組織選自2011年8-12月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院行胃鏡檢查并行內鏡下活檢患者。中國慢性胃炎共識意見指出:慢性萎縮性胃炎與胃癌發(fā)病率呈正相關;上皮內瘤變是胃癌最重要的癌前病變[12]。因此分類收集慢性非萎縮性胃炎10例,慢性萎縮性胃炎20例,上皮內瘤變14例。經患者或其委托人知情同意后收集相關一般信息。所有標本經由兩名以上病理醫(yī)師行病理學診斷。

1.2 方法

對所收集組織采用免疫組化法檢測CNTF的表達,表達量采用免疫組化評分進行表示。

1.2.1 免疫組化 所有組織標本使用4%多聚甲醛固定,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片。免疫組化實驗步驟參照SP免疫組化檢測試劑盒(博奧森,中國)說明書。切片60 ℃烘烤過夜后置于二甲苯中脫蠟,常規(guī)梯度酒精水化。采用高溫高壓抗原修復,山羊血清工作液封閉后,滴加1 ∶1 000稀釋兔抗人CNTF多克隆抗體(Abcam,英國)37 ℃孵育2 h,洗滌后加入生物素標記山羊抗兔IgG工作液,后滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液。DAB顯色,蘇木素復染細胞核,常規(guī)梯度酒精脫水,中性樹膠封片。

1.2.2 組化評分 顯微鏡下觀察切片,統(tǒng)計染色得分,具體方法[13]如下:著色細胞占總細胞比例0%,0%-10%,10%-50%,50%-80%,80%以上分別記0,1,2,3,4分;著色強度記為1分(淺著色),2分(中等著色)以及3分(強著色);將著色細胞數量比例得分與著色強度得分相乘所得即為染色得分。一個標本中任選5個高倍視野進行統(tǒng)計,最終該標本染色得分為5個分數均值。得分<6視為低表達,≥6分視為高表達。

1.3 隨訪及評價指標

以手術日為起始,采取電話、門診方式隨訪,頻率為每月1次。觀察終點為死亡。評價指標包括無進展生存期(progression free survival,PFS)及總生存期(overall survival,OS)。隨訪時間為1-88個月,中位隨訪時間35個月。因其他原因死亡及失訪視為截尾數據,共12例。

1.4 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計采用SPSS19.0軟件(SPSS,美國)行統(tǒng)計學分析。經檢驗資料數據符合正態(tài)分布,定量資料采用均數±標準差表示,癌組織與相應癌旁組織組間比較采取配對樣本t檢驗,慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎組間比較采用獨立樣本t檢驗,慢性胃炎、上皮內瘤變、胃癌組間比較采用方差分析。定性資料以例數表示。生存曲線使用Kaplan-Meier法繪制,并使用log-rank檢驗比較生存率。多因素分析采用Cox回歸模型。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CNTF在胃癌及不同病變胃黏膜組織中的表達

CNTF表達位置位于胞漿,表現(xiàn)為棕黃色云霧狀或顆粒(見圖1)。CNTF在胃癌及不同病變胃黏膜組織中的表達量見表1。其中慢性非萎縮性胃炎和萎縮性胃炎組織組化評分組間比較差異未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學意義(t=-0.201,P>0.05)。慢性胃炎、胃黏膜上皮內瘤變、胃癌組織的組化評分經檢驗發(fā)現(xiàn)組間差異有統(tǒng)計學意義(F=21.026,P<0.05)。兩兩比較發(fā)現(xiàn),胃癌組的組化評分高于胃黏膜上皮內瘤變組及胃炎組(P<0.05),但慢性胃炎及上皮內瘤變組間差異未提示統(tǒng)計學意義(P>0.05)。胃癌組組化評分高于相應癌旁組織(t=11.006,P<0.05)。

圖1 CNTF在慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃黏膜上皮內瘤變、胃癌、胃癌旁組織中的表達Figure 1 Expression of CNTF in chronic non-atrophy gastritis, chronic atrophy gastritis, gastric epithelial neoplasia, gastric cancer, corresponding precancerous tissues

表1 CNTF在胃癌及不同病變胃黏膜組織中的表達分析Table 1 Analysis of CNTF expression in gastric cancer and different gastric mucosa

2.2 CNTF表達與胃癌臨床病理特征的關系

CNTF的表達與胃癌病人年齡、性別未見明顯統(tǒng)計學關聯(lián);與病理分級、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期有一定關系(見表2)。

表2 CNTF表達與胃癌臨床病理特征的關系分析Table 2 Correlation between CNTF expression and clinical pathological characteristics of gastric cancer

2.3 生存分析

對胃癌病理隨訪時間1-88月,中位隨訪時間35月。入組病例1年生存率82.8%,2年生存率67.2%,3年生存率48.3%,5年生存率30.5%,至隨訪結束存活率23.4%。術后中位生存時間在CNTF陰性組為46月,在CNTF陽性組僅27月。CNTF陰性及陽性組Kaplan-Meier生存曲線見圖2,log-rank檢驗提示兩組間生存率差異存在統(tǒng)計學意義(χ2=15.157,P<0.05)。

圖2 CNTF不同表達胃癌患者生存曲線Figure 2 Survival curve of gastric cancer patients with different CNTF expression

多因素生存分析中,將2.2中已檢驗的與CNTF相關的臨床病理特征包括病理分級、原發(fā)灶浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期納入Cox回歸模型。表3結果顯示,浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、CNTF表達均為胃癌的顯著獨立預后因素。

表3 胃癌患者生存時間的Cox多因素分析Table 3 Cox multi-factor analysis of survival time in patients with stomach cancer

3 討論

腫瘤被公認為全身的系統(tǒng)性疾病,其發(fā)生發(fā)展可能與多項體內基因及內環(huán)境的改變相關,這過程中可能包括了神經內分泌調節(jié)系統(tǒng)。多個報道[14,15]顯示,神經營養(yǎng)因子可能參與了神經對非神經系統(tǒng)腫瘤組織的營養(yǎng)作用以及神經內分泌系統(tǒng)對腫瘤形成環(huán)境的調節(jié)。以往關于CNTF與腫瘤的報道多集中于神經系統(tǒng)。Weis等[16]在多個神經膠質瘤細胞系以及人組織標本中檢驗CNTF以及其受體的表達,發(fā)現(xiàn)在所有的星狀細胞瘤以及膠質母細胞瘤中,高達95%以上的腫瘤顯示出CNTF陽性。

CNTF也被證實與非神經系統(tǒng)實體腫瘤相關。Wan等[17]在針對肝細胞癌進行大規(guī)模功能基因篩選時發(fā)現(xiàn)CNTF/CNTFR與肝癌生長密切相關。Hu等[4]發(fā)現(xiàn)CNTF/CNTFR在多種肝癌細胞里高表達,而正常肝細胞中無表達,CNTF可以在不同細胞系中激活JAK/STAT、Ras/MAPK、PI3K/AKT以及AMPK通路,繼而調節(jié)腫瘤細胞糖代謝、促進肝癌細胞增殖及細胞周期改變。

CNTF因其蛋白結構隸屬于IL-6家族,IL-6樣細胞因子可以通過與細胞膜上含有gp130亞基的相應受體結合引發(fā)JAK-STAT途徑的活化,是最重要的該通路胞外激活因子[18]。CNTF相關通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展進程,其中的關鍵因子已成為胃癌靶向治療的重要靶點。Jackson等[19]研究證實磷酸化的STAT3高表達于胃癌細胞中,推測STAT3是胃癌發(fā)生及發(fā)展的早期事件。Kanda等[20]發(fā)現(xiàn),阻滯STAT3或JAK可以抑制survivin,減少細胞存活。Gong等[21]發(fā)現(xiàn)STAT3與VEGF在胃癌組織中有協(xié)同表達作用,也與血管生成有關。STAT3表達水平在不同腫瘤分期中有區(qū)別,證明與局部侵潤、淋巴結轉移與遠處轉移相關,影響到預后情況[6]。因此有利于推測CNTF與胃癌發(fā)生發(fā)展相關。

胃癌多具有明確的癌前狀態(tài)與病變階段,其腫瘤的發(fā)生模型可以被歸納為從慢性萎縮性胃炎等癌前疾病到癌前病變最終生成腫瘤的長達數年甚至數十年的過程[22]。因此本研究首先對不同病變的胃黏膜臨床標本中CNTF進行檢測。發(fā)現(xiàn)CNTF在慢性非萎縮性胃炎和慢性萎縮性胃炎組間表達差異不明顯。在慢性胃炎及上皮內瘤變組中表達差異也不明顯,但在胃癌組織中CNTF表達較慢性胃炎組織及癌前病變組織均可見顯著上升,也顯著高于相應癌旁組織,提示了CNTF在腫瘤發(fā)生過程中主要起到促進作用的過程,也提示了CNTF在腫瘤中表達的特異性。

在CNTF表達與胃癌臨床病理特征的研究中發(fā)現(xiàn),CNTF表達與年齡、性別的一般特征無明顯關聯(lián)。病理分級反映腫瘤惡性程度及預后,統(tǒng)計分析提示CNTF表達量在中高分化組低于低分化-未分化組,側面提示了CNTF與疾病進程、預后的關聯(lián)性。CNTF表達與腫瘤局部浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期相關。以上因素是胃癌臨床分期的決定性因素,也是代表胃癌遠期預后最關鍵的特征,在既往的報道中,均以胃癌的獨立預后因素存在[23,24]。因此提示CNTF的表達可能與腫瘤發(fā)展、轉移相關,進而影響病人預后。

在進一步的生存分析中發(fā)現(xiàn)CNTF陽性病人生存率低于CNTF陰性病人。將影響預后及與CNTF表達相關的關鍵特征納入多因素分析中,發(fā)現(xiàn)除腫瘤局部浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期以外,CNTF表達也是影響病人預后的獨立危險因素,證實了CNTF表達與胃癌預后的關系。

綜上,CNTF在胃癌、不典型增生、胃炎胃黏膜中存在差異性表達;CNTF表達量與腫瘤臨床病理分級分期相關,并且是胃癌的獨立預后因素。提示CNTF可能參與了胃癌發(fā)生、進展、遠處轉移等過程,并影響疾病預后。之后的工作會通過對CNTF幾條主要通路的研究繼續(xù)明確其具體作用機制,挖掘CNTF可能的臨床價值。