郭艷杰,文 和,衛(wèi)錦娟,王 瑩,倪四峰,馬 煒,王長鷹,陳 寧(西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院心內(nèi)科,西安 70075;空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系;空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院心內(nèi)科;西北農(nóng)林科技大學醫(yī)院;通訊作者,E-mail:0605@qq.com)

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)報道,預計到2040年,全球肥胖人數(shù)將超過5億,2型糖尿病患者人數(shù)將超過6.42億[1]。肥胖與2型糖尿病常常前后發(fā)生,并伴隨有高脂血癥和胰島素敏感性降低[2]。諸多研究[3,4]表明,肥胖、2型糖尿病的出現(xiàn)將嚴重危害心血管健康,二者會導致心臟出現(xiàn)代謝紊亂、脂質堆積、氧化應激損傷加劇等諸多不良改變,最終損害心臟功能,嚴重時將導致心衰的發(fā)生。來自歐洲的一項統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,超過80%的心衰患者為肥胖人群[5]。

脂肪酸是心臟能量供給的重要來源,正常心肌組織70%-90%的能量來自脂肪酸的β氧化。由于肥胖人群常常存在高脂血癥并伴隨胰島素敏感性降低,心肌組織對糖的利用率進一步降低,對脂肪酸的吸收利用進一步增加[6]。同時,肥胖患者常常存在心肌線粒體功能損傷,導致大量脂肪酸無法在心肌組織中被完全氧化利用[7]。大量的脂肪酸及其中間代謝產(chǎn)物(二?；视?、游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺等)在心肌組織堆積,干擾心肌組織生物信號的正常傳遞,過量蓄積的過氧化脂質還將極大加重心肌組織的氧化應激損傷[8]。因此,有效地促進心肌組織脂質的完全代謝,減少脂質及其中間代謝產(chǎn)物的堆積,是抵抗肥胖誘導的心肌損傷的重要途徑。

煙酰胺核糖(nicotinamide riboside, NR)是一類存在于牛奶中的小分子物質,屬B族維生素衍生物。既往研究表明,煙酰胺核糖具有抗氧化、抗衰老、心血管保護等治療效果[9]。發(fā)表在CellMetabolism的一項研究意外發(fā)現(xiàn),NR能夠抵抗高脂飲食誘導的肥胖[10],提示NR可能與脂質代謝存在密切聯(lián)系,但是該研究未對NR是否能夠促進心肌脂代謝及其具體機制作深入探討,本研究通過建立肥胖動物模型及高脂細胞模型,并給予外源性NR干預,觀察NR對于心臟功能、心肌組織脂質代謝的影響,并探尋其具體機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級野生型C57BL小鼠24只,鼠齡8周齡,體質量20-25 g,購自常州卡文斯模式動物中心。

1.1.2 試劑 高脂飼料購自美國Research Diet公司;煙酰胺核糖購自美國Sigma公司;神經(jīng)酰胺含量測試盒購自碧云天生物公司;游離脂肪酸含量測試盒購自美國默克公司;過氧化脂質含量測試盒購自美國默克公司;線粒體綠色熒光探針購自美國Thermo公司;脂肪酸紅色熒光探針購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型的建立 24只8周齡雄性小鼠隨機分為3組:正常飲食組(Con組)、高脂飲食組(HFD組)、高脂飲食+煙酰胺核糖組(HFD+NR組),每組8只。高脂飲食組給予高脂飲食喂養(yǎng)4個月以誘導肥胖小鼠模型。高脂飲食+煙酰胺核糖組給予高脂喂養(yǎng)4個月,在高脂喂養(yǎng)的第3月初開始同時給予800 mg/kg的NR溶于生理鹽水中灌胃,持續(xù)灌胃2個月。

1.2.2 超聲心動圖檢測小鼠心臟功能 使用高分辨率超聲儀檢測小鼠心臟功能;以異氟烷麻醉小鼠,將小鼠固定在恒溫墊上。獲取胸骨旁長軸切面的M型超聲心動圖,軟件自動測算左心室射血分數(shù)以及左心室短軸縮短率。

1.2.3 心肌組織油紅O染色 將取下的心臟標本置于4%的多聚甲醛溶液中,冰凍條件下切片。按照油紅O染色試劑盒(西安中暉赫彩生物)說明書制備油紅O染色工作液并進行染色,染色完成后光鏡下觀察并拍照。

1.2.4 原代心肌細胞的提取和培養(yǎng) 選擇1-3日齡的SD大鼠乳鼠,放入75%酒精溶液充分浸泡消毒,取出心臟,放置于PBS中充分清洗,剪碎,加入Ⅰ型膠原酶消化30 min,取消化液離心重懸鋪板。將細胞分為正常培養(yǎng)組(Con組),高脂培養(yǎng)組(Pal組)和高脂培養(yǎng)+煙酰胺核糖組(Pal+NR組)。Con組給予含25 mmol/L葡萄糖+10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;Pal組在Con組基礎上同時給予500 μmol/L的棕櫚酸培養(yǎng)24 h;Pal+NR組在Pal組基礎上同時加入2 mmol/L的煙酰胺核糖培養(yǎng)24 h。

1.2.5 心肌組織神經(jīng)酰胺、游離脂肪酸、二?；视秃康臋z測 取新鮮心肌組織,充分研磨,離心后取上清。使用美國BD公司的神經(jīng)酰胺含量測試盒、游離脂肪酸含量測試盒和二酰基甘油含量檢測試劑盒,所有操作均按照試劑盒說明書嚴格執(zhí)行,規(guī)范操作后上機,酶標儀分析獲得數(shù)據(jù)。

1.2.6 Seahorse檢測心肌細胞脂肪酸β-氧化效率 提前將原代心肌細胞種植于特制的細胞培養(yǎng)板中(V7-PS,安捷倫公司),并給予高脂或NR處理24 h。檢測當天,將培養(yǎng)基更換為Seahorse檢測液,置入37 ℃孵箱穩(wěn)定1 h。依次加入寡霉素、FCCP和抗霉素,由Seahorse檢測儀通過檢測探頭分別檢測細胞基礎氧耗值,ATP生成相關的氧耗值和最大氧耗值。依托莫西(Etomoxir)為脂肪酸β氧化的抑制劑,對照組加入依托莫西后降低的差值即為脂肪酸依賴的線粒體氧耗率。

1.2.7 線粒體、脂肪酸的染色 按照說明書操作步驟制備線粒體探針染色工作液(Mito-tracker green, thermo公司),直接向細胞培養(yǎng)基中加入2 μl/ml的線粒體染色工作液進行染色,放入孵箱中避光孵育30 min,即可在共聚焦顯微鏡下觀察拍照。脂肪酸染色需提前16 h向培養(yǎng)基中加入0.2 μl/ml的Bodipy 558/568 C12工作液(thermo公司,美國),培養(yǎng)16 h后即可在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 煙酰胺核糖對高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠心臟功能的影響

相比于正常喂養(yǎng)小鼠,高脂飲食喂養(yǎng)小鼠4個月后,小鼠心臟功能出現(xiàn)顯著損傷,表現(xiàn)在高脂飲食組小鼠左心室射血分數(shù)顯著低于正常飲食組(P<0.05);左心室短軸縮短率顯著低于正常飲食組(P<0.05)。相比于單純高脂飲食組,煙酰胺核糖治療組的小鼠心臟功能出現(xiàn)了顯著的改善,左心室射血分數(shù)顯著升高(P<0.05)左心室短軸縮短率顯著升高(P<0.05,見圖1)。

2.2 煙酰胺核糖對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠體質量及心臟脂質含量的影響

相比于正常喂養(yǎng)組,高脂飲食組喂養(yǎng)小鼠4個月后,小鼠體質量顯著升高(P<0.05);相比于單純高脂飲食組,煙酰胺核糖治療組小鼠體質量顯著下降(P<0.05)。油紅O染色顯示,相比于正常飲食組,高脂飲食組小鼠心肌組織出現(xiàn)了大量脂質堆積(見圖2,左上脂質染色呈現(xiàn)棕紅色點狀,棕紅色深者脂質堆積更加顯著)。此外,相比于正常飲食組,高脂飲食組小鼠心肌組織的神經(jīng)酰胺含量、游離脂肪酸含量以及過氧化脂質含量也顯著增多(P<0.05)。相比于單純高脂組,煙酰胺核糖治療組小鼠心肌組織的脂滴含量、神經(jīng)酰胺含量、游離脂肪酸含量以及過氧化脂質含量都出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)。

2.3 煙酰胺核糖對原代心肌細胞脂肪酸氧化效率的影響

Seahorse檢測脂肪酸-線粒體熒光共染結果顯示,相比于高脂處理組,煙酰胺核糖+高脂處理組脂代謝相關的基礎氧耗率和最大氧耗率均出現(xiàn)了顯著升高(P<0.05,見圖3),表明煙酰胺核糖能夠顯著增加原代心肌細胞的脂肪酸氧化代謝效率。

2.4 煙酰胺核糖對原代心肌細胞脂肪酸分布的影響

線粒體脂肪酸共染結果顯示,正常培養(yǎng)組原代心肌細胞中,脂肪酸與線粒體能夠基本重合(92.1%±3.3%),表明絕大部分脂肪酸進入線粒體進行β-氧化。高脂處理細胞后,大部分脂肪酸聚集于細胞其他部分,未進入線粒體氧化,脂肪酸與線粒體的重合率出現(xiàn)了顯著下降(34.2%±4.2%)。在給予外源性NR后,脂肪酸重新進入線粒體,脂肪酸與線粒體的重合率出現(xiàn)了顯著改善(58.4%±8.1%),表明煙酰胺核糖可能通過促進脂肪酸進入線粒體β-氧化加速脂肪酸氧化效率,從而改善心肌組織脂質堆積。

3 討論

發(fā)表在柳葉刀雜志的最新研究結果表明,中國成年人中已經(jīng)有超過一半的人群存在超重或肥胖[11]。肥胖、高脂血癥和脂代謝異常與心血管疾病的發(fā)生密切相關。脂質是心肌組織的主要能量來源,正常情況下,心肌組織大約70%-90%的能量供給依賴于脂肪酸的β-氧化。由于肥胖患者往往伴發(fā)胰島素抵抗癥狀,導致心肌組織對糖的利用進一步減少,對脂肪酸的依賴程度進一步增加。線粒體是心肌細胞的能量功能,也是脂肪酸進行β-氧化的唯一場所。大量研究指出,肥胖、2型糖尿病患者心肌組織往往存在大量的脂質堆積,表現(xiàn)為脂滴增多和游離脂肪酸含量增多[12,13],本研究也證實了在高脂喂養(yǎng)小鼠心肌組織中,心肌組織的脂滴、游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺以及過氧化脂質顯著增多。神經(jīng)酰胺是細胞內(nèi)重要的信號分子,在細胞內(nèi)承擔第二信使的重要角色,心肌組織神經(jīng)酰胺的異常增多將嚴重擾亂心肌細胞中正常的生物信號傳遞,危害心肌細胞功能[14]。過氧化脂質是脂肪酸被氧化后的產(chǎn)物,是細胞內(nèi)氧化應激損傷的標志物和重要來源,心肌細胞中過氧化脂質的增多將大大加重心肌細胞的氧化應激損傷,造成細胞凋亡,最終造成心臟功能損傷。本研究結果也證實,高脂飲食能夠直接誘導心臟功能損傷。如何有效地將脂肪酸轉移進入線粒體使之完全氧化分解為無害的終末產(chǎn)物,是解決心肌組織脂毒性的重要途徑。

圖4 煙酰胺核糖對原代心肌細胞脂肪酸分布的影響 (n=6-8)Figure 4 Effect of NR on fatty acid distribution in cardiomyocytes (n=6-8)

既往研究[10]提示,煙酰胺核糖可能與脂肪酸代謝存在一定的關聯(lián),即煙酰胺核糖可能有一定的減肥效果。本實驗研究結果也表明,對于高脂飲食誘導的肥胖,外源性給予煙酰胺核糖具有顯著抑制體質量增加的效果,但其具體內(nèi)在機制有待進一步研究。具體到心肌組織,本研究表明,外源性煙酰胺核糖能夠顯著減少心肌組織中的脂質及其中間代謝產(chǎn)物的堆積。心臟超聲功能檢測進一步證實了外源性煙酰胺核糖對于心臟功能的保護作用。正常情況下,細胞中的脂質大部分進入線粒體中進行氧化分解。然而2019年發(fā)表在DevelopmentalCell雜志的研究表明,當細胞內(nèi)部無法消耗過多的脂質時,細胞會通過出泡的方式將多余的脂質排出細胞[15]。為了明確煙酰胺核糖是通過促進脂質的氧化還是促進脂質的排出,我們首先對線粒體的脂肪酸代謝效率進行了檢測,結果表明,煙酰胺核糖能夠顯著提高線粒體的脂肪酸代謝效率。進一步用兩種不同探針的檢測結果表明,煙酰胺核糖能夠直接促進脂肪酸進入線粒體,為脂肪酸的完全氧化創(chuàng)造條件。煙酰胺核糖已經(jīng)不止一次出現(xiàn)在人們的視野中。既往認為,煙酰胺核糖在細胞內(nèi)轉化為NAD+,并進一步以SIRT家族依賴性的方式發(fā)揮作用[16,17]。本研究首次在動物和細胞層面指出,煙酰胺核糖能夠顯著改善高脂誘導的心肌損傷,并進一步指出煙酰胺核糖能夠直接促進脂肪酸進入線粒體進而促進脂肪酸的β-氧化,從而抵抗高脂喂養(yǎng)引起的心臟脂質堆積。煙酰胺核糖這一作用的具體機制尚未完全闡釋,針對此問題本課題正在作進一步深入研究。

綜上,本研究首次證實,外源性給予NR能夠促進心肌細胞脂肪酸進入線粒體氧化代謝,從而減少高脂誘導的心肌組織脂質堆積,最終抵抗高脂飲食誘導的心臟功能損傷。本研究對于臨床肥胖患者心臟功能損傷的藥物治療具有一定的啟發(fā)意義。