陳娟娟等

摘要： 從冷藏的醬鴨中分離篩選乳酸菌，對其進行生理生化特性研究和分子學(xué)鑒定。結(jié)果表明，從冷藏醬鴨中篩選到2株優(yōu)良乳酸菌，分別命名為J1、J2。結(jié)合細菌形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA序列同源性以及系統(tǒng)進化樹分析表明J1、J2為副干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus paracasei subsp.），具有比較好的發(fā)酵產(chǎn)酸的能力，并且對大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）具有很強的抑制作用，能夠耐受極端的pH環(huán)境。

關(guān)鍵字：醬鴨；乳酸菌；分離；鑒定

中圖分類號：Q939.11+7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0676-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.044

Identification and Biological Characteristics of Lactic Acid Bacteria Isolation

from the Sauce Duck in Low Temperature

CHEN Juan-juan1，ZHOU Yan-qing1，LI Jing-yun1，ZHANG Yu1，WANG Wan-shen1，F(xiàn)AN Yu-xia1，

CHANG Zhao1，YUE Xiao-jie1，YUAN Lu-lu2

（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China；

2. Zhoukou Science and Technology Bureau，Zhoukou 466000，Henan， China）

Abstract： The research aimed to isolate and screen the fine lactic acid bacteria from the sauce duck in low temperature and identify them by molecule and biochemical test. Two strains of lactic acid bacteria were isolated and named J1 and J2. With the analysis of bacterial morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA sequence homology and phylogenetic tree analysis， it showed that J1 and J2 were Lactobacillus paracasei subsp. J1 and J2 have a good ability to produce acid fermentation and to inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus， and both can tolerate extreme pH environment.

Key words： sauce duck； lactic acid bacteria； isolation； identification

乳酸菌是一種常見的益生菌，具有直接為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)、促進人和動物生長、調(diào)節(jié)胃腸道及泌尿生殖道的正常菌群、增強機體免疫和維持微生態(tài)平衡等多種功能[1]，被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、食品、飼料工業(yè)和環(huán)保等方面。乳酸菌在自然界分布廣泛，從人體及動物的腸道，到植物、發(fā)酵食物、飲料乃至土壤中都存在乳酸菌。曾經(jīng)有研究者報道過從腸道內(nèi)容物[2]，發(fā)酵的乳制品[3，4]，腌制的泡菜[5，6]，冷藏的鮮肉[7]，發(fā)酵的肉制品[8]中分離出各種優(yōu)質(zhì)乳酸菌。

肉類中，鴨是一種常見的加工原材料，可以直接或發(fā)酵后制成板鴨、鹵鴨、醬鴨、蝦油鴨等[9，10]，每一種做法都會賦予其特殊的風(fēng)味。乳酸菌在發(fā)酵的過程中可以產(chǎn)生乙醛和雙乙酰等風(fēng)味物質(zhì)，從而使發(fā)酵制品具有特殊的風(fēng)味，而發(fā)酵的鴨類可能是因為乳酸菌產(chǎn)生了一些風(fēng)味物質(zhì)，使其有了獨特的風(fēng)味。林巧[9]從發(fā)酵的建昌板鴨中分離到了17株菌株，通過形態(tài)學(xué)和生理生化特征進行了鑒定，并從中篩選出了一株耐鹽的適合發(fā)酵板鴨的菌株。本研究旨在從冷藏的醬鴨中分離乳酸菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征和基因?qū)W進行鑒定，再通過發(fā)酵產(chǎn)酸試驗、低pH耐受試驗、抑菌試驗等進一步研究其特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 從河南省新鄉(xiāng)市溫州醬鴨店購買一只醬鴨，放于無菌的袋子里并放進冰盒內(nèi)，帶回實驗室于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，葡萄糖產(chǎn)酸培養(yǎng)基，葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸培養(yǎng)基，脫脂奶粉培養(yǎng)基，按文獻[11]的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離及篩選 將放在4 ℃冰箱2周的醬鴨取出，用無菌解剖剪取1 g，并且充分剪碎，加入9 mL無菌生理鹽水中，充分搖勻，然后依次稀釋到10-4、10-5、10-6，分別吸取100 μL接種在含1.5%的CaCO3的MRS平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。挑取具有透明圈的單菌落劃線純化，連續(xù)純化3次，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定 參照文獻[11]，通過革蘭氏染色、接觸酶反應(yīng)、運動性試驗、明膠液化試驗、葡萄糖和葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗、甘油發(fā)酵試驗、D-山梨醇發(fā)酵試驗、淀粉發(fā)酵試驗、蔗糖發(fā)酵試驗等對分離到的乳酸菌進行初步的鑒定[11]。

1.2.3 乳酸菌的分子鑒定 將活化好的菌株利用CTAB的方法提取菌株的總DNA，以基因組DNA為模版擴增16S rRNA。引物是用Chao等[12]報道過的引物，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1541R： AAGGAGGTGATCCAGCCGCA擴增其16S rRNA，引物由華大生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×EasyTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL， EasyTaq 0.25 μL，模版DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，無菌去離子水16.75 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s ，55 ℃30 s ，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收1 500 bp左右的片段，用生工生物工程（上海）有限公司的膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較，并且用MEGA5.05建系統(tǒng)進化樹做進一步的分析。

1.2.4 乳酸菌產(chǎn)酸能力的測定 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸的能力是作為發(fā)酵酸奶的優(yōu)良菌株篩選的重要指標。酸奶的酸度一般以中和100 mL牛乳所需的0.1 mol/L氫氧化鈉的毫升數(shù)來表示，稱為°T，此為滴定酸度簡稱為酸度。將待測菌株接種于MRS培養(yǎng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，活化3代，以充分活化實驗菌株。將活化好的菌株按3%的接種量接種于裝有10%脫脂乳培養(yǎng)基的試管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至凝乳，記錄凝乳時間。凝乳后置于4 ℃冰箱中后熟24 h，測定每個管的pH和滴定酸度。每株3個重復(fù)。

pH的測定用PHS-320型酸度計測量，測酸度用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定，采用吉爾涅爾度（°T）表示，按參考文獻[13]。具體步驟：量取10 mL鮮乳，注入150 mL三角燒瓶內(nèi)，用20 mL中性蒸餾水稀釋，加入1%酚酞指示劑5滴，小心混勻，用0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定，不斷搖動，直至微紅色在1 min不消失為止。將滴定時所耗的0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液的量乘以10，即為100 mL酸奶的酸度。

1.2.5 乳酸菌耐酸能力的測定[14] 將待測菌株接種于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，8 000 r/min，4 ℃離心10 min。細胞沉淀用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液沖洗2次，并懸浮至細胞密度為1×1012個/mL。然后加到pH為1.0、2.0、3.0的磷酸鹽緩沖液中32 ℃孵育，每1、2、3、4 h取出100 μL接種在MRS平板培養(yǎng)基上，同時取100 μL沒有經(jīng)過低pH磷酸鹽緩沖液處理的菌液接種在MRS平板培養(yǎng)基上，34 ℃培養(yǎng)48 h，最后記錄平板上的單菌落個數(shù)。乳酸菌的存活率的計算方法是用低pH處理過的單菌落數(shù)除以沒有經(jīng)過處理的單菌落數(shù)。

1.2.6 乳酸菌的抑菌能力測定[14] 將待測菌株接種在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代后，取100 μL接種在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH為5.5（pH 5.5時抑菌能力最大），用來檢測抑菌活性。指示菌株有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。在雙層平板上用無菌打孔器打出直徑為6 mm的孔，將100 μL無菌的培養(yǎng)液加入孔內(nèi)，以不溢出為宜，于4 ℃過夜使加入的培養(yǎng)液充分擴散，37 ℃培養(yǎng)48 h。抑菌能力通過測量抑菌圈的直徑來表示，單位為mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選結(jié)果

從冷藏醬鴨中分離得到表面光滑濕潤、邊緣整齊、乳白色的菌株共25株，分別命名為J1、J2、J3、J4…J24、J25。其中J1、J2的透明圈最大，透明圈越大說明其產(chǎn)酸能力越強，發(fā)酵能力就越強。故對J1、J2進行了鑒定及性能研究。

2.2 菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌落及菌體形態(tài)特征鑒定 J1、J2的菌落及菌體特征見表1。從表1中的菌落形態(tài)以及菌體形態(tài)可以鑒定這2株菌株為桿菌，并且可以初步鑒定為疑似乳酸菌。

2.2.2 生理生化鑒定 生理生化鑒定結(jié)果如表2，結(jié)合菌落和菌體形態(tài)，可以初步判斷這2株菌株是乳酸桿菌。J1、J2均可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，發(fā)酵葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣，因此可以判J1、J2為兼性異型發(fā)酵的乳酸桿菌。

2.2.3 16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物和測序結(jié)果 將J1、J2用液體培養(yǎng)基活化3次后提取細菌基因組DNA，進行16S rRNA PCR擴增、回收、測序，獲得長度分別為1 512 bp和1 516 bp的堿基序列，將這兩個序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對發(fā)現(xiàn)J1、J2與干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌亞種、干酪乳桿菌亞種、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的同源性都達到了99%。按照目前通用的分類標準：具有99%～100%序列相似性的判定為1個種，具有97%～99%序列相似性的判定為1個屬，可將J1、J2判定為乳桿菌屬。下載干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌亞種、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的16S rRNA的序列，用MEGA5.05建系統(tǒng)進化樹如圖1，從圖1中可知，J1、J2與副干酪乳桿菌亞種（L. paracasei subsp R094， L. paracasei subsp. NBRC 15906）在一個分支上，結(jié)合NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast比對結(jié)果，可以將J1、J2鑒定為副干酪乳桿菌亞種。

2.3 乳酸菌的性能測定結(jié)果

2.3.1 乳酸菌的產(chǎn)酸能力 乳酸菌發(fā)酵脫脂奶粉產(chǎn)酸的能力是發(fā)酵酸奶優(yōu)質(zhì)菌株的重要指標。J1、J2乳酸菌的發(fā)酵脫脂奶粉產(chǎn)酸結(jié)果如表3，從表3可知，這兩株菌株發(fā)酵酸奶時酸度都比較低，說明其發(fā)酵產(chǎn)酸的能力比較強，可能是潛在的優(yōu)良菌株。

2.3.2 乳酸菌的耐酸能力 人體胃的pH介于1.5～20，因此能夠耐受極端的pH是益生菌的另一個重要特征。圖2簡單地說明了J1、J2在pH 1.0、2.0、3.0的條件下1、2、3、4 h存活率。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)J1、J2在pH 3.0的條件下，1 h之后的存活率分別為70%、76%，4 h之后仍然有存活的菌株，并且在pH 1.0和2.0的條件下，4 h后也仍然有存活菌株，說明J1、J2具有一定的耐酸的能力。

2.3.3 乳酸菌的抑菌能力 經(jīng)過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)J1、J2這兩株菌株對大腸桿菌（E. coli）和金黃色葡萄（Staphylococcus aureus）具有很強的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到了15 mm以上，對大腸桿菌的抑菌圈直徑甚至達到了30 mm以上（表4）。

3 小結(jié)與討論

該研究從冷藏醬鴨中分離篩選到的2株菌株經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rRNA序列鑒定為副干酪乳桿菌亞種，分別命名為J1、J2。通過對其性能的研究發(fā)現(xiàn)J1、J2具有很強的發(fā)酵產(chǎn)酸和抑菌的能力，并且具備一定的極端pH環(huán)境的耐受能力。另外，陳艷梅[15]從酸奶中分離到的乳酸菌發(fā)酵脫脂奶粉產(chǎn)酸的最低的pH是4.35，而J1、J2達到了4.30、4.36，說明J1、J2發(fā)酵產(chǎn)酸的能力與用于酸奶發(fā)酵菌株的發(fā)酵能力不差上下。同時，從抑菌試驗結(jié)果中可以看出，J1、J2具有一定的抑菌能力，尤其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有很強的抑制作用，對金黃色葡萄球菌抑菌圈的直徑達到了15 mm以上，對大腸桿菌的抑菌圈直徑甚至達到了30 mm以上。Iyer等[14]報道過從米糕中分離到的2株抑菌能力強的菌株對大腸桿菌的抑菌圈的直徑達到了9 mm以上，與之相比，J1、J2具有更強的抑菌能力?；粜＄萚16]從酸馬奶中分離到了10株乳酸菌，并做了大腸桿菌的抑菌試驗，其中抑菌圈直徑最大是16.30 mm，進一步表明乳酸菌J1、J2的抑菌能力強。J1、J2還具有一定的耐受低pH的能力，可以在pH為1、2、3的條件下4 h之后仍能夠存活，說明其能耐受低pH?？偟膩碚f，J1、J2具有發(fā)酵能力強、抑菌能力強、耐酸等特性，是兩株優(yōu)良的乳酸菌。

本研究從冷藏醬鴨中分離篩選到了2株副干酪乳桿菌亞種，其具有很強的發(fā)酵產(chǎn)酸、抑菌以及耐酸等能力，是優(yōu)良的益生菌菌株，可用于發(fā)酵制品的研究。另外因J1、J2具有很強的抑菌能力，具有保藏醬鴨以及其他儲藏食品的潛力。

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