高　潔, 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京　100050）

·綜述·

鼠諾如病毒特性、免疫學(xué)及檢測方法研究進(jìn)展

高潔, 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京100050）

鼠諾如病毒（murine norovirus, MNV）是唯一可在體外有效擴(kuò)增的諾如病毒, 其病毒株的分離及在鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的增殖成功為諾如病毒分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ), 也為人類諾如病毒（HuNoVs）致病機(jī)制的研究和疫苗的制備提供了幫助。MNV是小鼠中傳播最廣泛的感染因子之一, 具嗜免疫細(xì)胞性, 對免疫缺陷小鼠可產(chǎn)生致死性, 加強(qiáng)該病毒感染的控制具有重要意義。

鼠諾如病毒（MNV）； 特性； 機(jī)制； 檢測

腸胃炎是造成全球發(fā)病率和死亡率的主要因素，尤其是在發(fā)展中國家。每年約有10億例兒童急性腹瀉發(fā)生，造成250萬人死亡。人類諾如病毒（HuNoVs）是非細(xì)菌性腸胃炎在全球各年齡段流行的主要病原體, 每年引起五歲以下兒童死亡約20萬例［1］。有報道稱，全球90%以上的非細(xì)菌性腸胃炎都是由HuNoVs引起的［2］。由于缺乏有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，有關(guān)人類諾如病毒感染、復(fù)制、致病機(jī)理以及抗病毒制劑的研究始終難有作為。鼠諾如病毒（murine norovirus, MNV）是唯一可在體外有效擴(kuò)增的諾如病毒［3］，MNV病毒株的分離及其在鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的增殖成功為諾如病毒分子機(jī)制的研究提供了細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動物模型。在一定程度上，MNV在某些免疫缺陷動物中的感染癥狀與人類相似，這使MNV成為研究人類諾如病毒生物學(xué)特征的最佳替代模型［4,5］。

實驗動物的微生物感染可嚴(yán)重影響研究數(shù)據(jù)的有效性和重現(xiàn)性。確保動物無干擾實驗的病原體感染可減少實驗用動物數(shù)量，這也充分體現(xiàn)了動物福利的3R原則。我國國家標(biāo)準(zhǔn)未將MNV列為排除的對象，但由于其感染小鼠后主要進(jìn)入免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）［3］的特殊性, 以及MNV在實驗動物群體中的廣泛流行, 人們開始逐步關(guān)注鼠諾如病毒在實驗動物群體中的感染特征、流行特點、致病機(jī)理和預(yù)防控制。國外有調(diào)查表明, 鼠諾如病毒是小鼠中傳播最廣泛的感染因子之一［6,7］。因此，加強(qiáng)該病毒感染的控制具有重要意義, 目前, MNV已被一些研究機(jī)構(gòu)列入實驗小鼠常規(guī)檢測項目［6,7］。

1　鼠諾如病毒特性

1.1鼠諾如病毒的結(jié)構(gòu)特點

M N V屬杯狀病毒科諾如病毒屬，其原型MNV-1最早于免疫缺陷小鼠（RAG2-/-/STAT 1-/-）中分離得到［8］。MNV是單股正鏈RNA病毒，其核酸大小約7.4～7.6 kb，主要包括3個開放閱讀框（open reading frames, ORFs），并具諾如病毒多聚腺苷酸A尾特征［8］。ORF1編碼多聚蛋白, 進(jìn)而被3C蛋白酶解為6個病毒非結(jié)構(gòu)（non-structural, NS）蛋白（NS1/ NS2，NS3，NS4，NS5，NS6和NS7）。ORF2編碼主要衣殼蛋白或病毒蛋白1（viral protein1, VP1），諾如病毒衣殼蛋白由180個VP1分子排列形成二十面體，每個衣殼蛋白可分為N段臂結(jié)構(gòu)域、S結(jié)構(gòu)域（shell domain）及C端P結(jié)構(gòu)域（protruding domain），后兩者由一個較短的鉸鏈連接，且S結(jié)構(gòu)域與P結(jié)構(gòu)域相比更保守。S結(jié)構(gòu)域在病毒基因組表面形成光滑的殼狀結(jié)構(gòu)，但不能與受體結(jié)合。P結(jié)構(gòu)域是二聚體，在衣殼蛋白表面形成弧狀結(jié)構(gòu)。P結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分為P1（弧狀結(jié)構(gòu)的主干）和P2（弧狀結(jié)構(gòu)的頂部）亞結(jié)構(gòu)域，P1亞結(jié)構(gòu)域和S結(jié)構(gòu)域較為保守，P2亞結(jié)構(gòu)域高度可變且含有免疫和細(xì)胞識別位點［9］。ORF3編碼小分子堿性蛋白或VP2，其在病毒顆粒中可見，且與病毒顆粒的穩(wěn)定性有關(guān)［10］，也有研究［11］表明VP2可抑制抗原提呈細(xì)胞成熟。Thackray等［12］對已知的MNV序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MNV基因組含有ORF4，其與ORF2有重疊，在不同的分離株中處于不同的閱讀框, 其編碼的蛋白成為毒力因子1（virulence factor 1）, 并參與固有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。ORF4在人、牛、豬諾如病毒中并未發(fā)現(xiàn)，但在杯狀病毒科另一種屬的I型札幌病毒發(fā)現(xiàn)有相似的ORF與VP1編碼區(qū)重疊。1.2鼠諾如病毒流行概況

MNV是一種胃腸道病原體，經(jīng)糞便排出，主要通過糞口途徑傳播, 也可經(jīng)呼吸道傳播［13］, 其分子特征和生物學(xué)特性與人相似［14］。人諾如病毒基因組全長變異在核苷酸水平為45%，其中VP1序列的變異可達(dá)57%［15］。對不同MNV分離株全基因組序列比較顯示其相似性在核苷酸水平可達(dá)78%以上，氨基酸水平差異大約為11%。目前，我國只有2個MNV分離株，其全基因組相似性約為89%［16,17］。有研究［18］對MNV基因組全長序列進(jìn)行分析表明, 序列中只有3個區(qū)域有超過連續(xù)30個核苷酸的保守結(jié)構(gòu)，基因組5'端的32個核苷酸、ORF1和ORF2連接處的64個核苷酸均處于保守區(qū)域，第3個保守區(qū)域位于ORF2和ORF4內(nèi)，有47個核苷酸是完全保守的。盡管鼠諾如病毒的序列差異有限，不同分離株的生物學(xué)表型仍顯示出多樣性，如在進(jìn)化上密切相關(guān)的病毒株，其在RAW264.7單層細(xì)胞形成蝕斑及感染野生小鼠的能力是不同的； 從糞便中分離到到的MNV S99與CR3能在野生型小鼠中存在至少35 d，而MNV-1在小鼠中可引起急性感染，感染7 d后糞便中便檢測不到病毒。病毒的持續(xù)性感染和結(jié)腸傾向性可定位于非結(jié)構(gòu)蛋白S1/S2的一個氨基酸殘基［19］。也有研究［12］表明，不同MNV病毒株產(chǎn)生的免疫效果有差異與其VP2調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞成熟的能力及VF1對細(xì)胞因子的作用有關(guān)。Baldridge 等［2］研究諾如病毒和腸道細(xì)菌的相互作用時發(fā)現(xiàn)，腸道微生物組中的細(xì)菌組分在控制諾如病毒水平、建立持續(xù)感染時發(fā)揮重要作用，而抗生素能大幅改變腸道病毒感染的致病機(jī)制，它可預(yù)防諾如病毒在小鼠中的持續(xù)感染?？股仉m不能預(yù)防組織感染和系統(tǒng)病毒復(fù)制，但可有效作用于腸道。在抗生素預(yù)防病毒持續(xù)感染過程中，抗病毒細(xì)胞因子干擾素λ，干擾素λ受體1及轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1, 干擾素調(diào)節(jié)因子3等發(fā)揮重要作用，因此，腸道細(xì)菌組以抵消固有免疫系統(tǒng)特定成分的方式促進(jìn)腸道病毒持續(xù)性感染。

2003年發(fā)現(xiàn)并成功分離MNV-1后，世界上許多地區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)該病毒并得到不同的分離株。無論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，此病毒在實驗動物設(shè)施中都有很高的感染率［6,7］。Kitajima等［9］采用巢式RT-PCR（nested reverse transcription-PCR）對日本六個獨立實驗動物設(shè)施小鼠糞便樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)MNV陽性率為22%（8/37），這是關(guān)于MNV在日本流行的首例報道。隨后，有研究者［7］對日本和美國普通級小鼠、SPF級小鼠以及商業(yè)化實驗小鼠中MNV的自然感染進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)顯示MNV是實驗用小鼠中感染率最高的病原體，其中，日本普通級小鼠MNV抗體陽性率為67.3%，SPF級小鼠為39.1%，商業(yè)化SPF級C57BL/6實驗小鼠為20%，美國商業(yè)化普通級小鼠MNV抗體陽性率為62.5%。西歐對100多個設(shè)施中實驗大、小鼠流行的24種病毒及支原體檢測結(jié)果顯示［6］，在小鼠群體中，MNV是感染率最高的病原體，陽性率約為31.8%，該結(jié)果與另一項對42 000多只小鼠MNV抗體陽性率結(jié)果（32.4%）基本一致［20］。2010年，袁文等［16］首次報道我國廣東省實驗小鼠攜帶有MNV，攜帶率為37.38%（77/206）。北京地區(qū)對600只小鼠進(jìn)行ELISA檢測顯示MNV感染率為11.67%，其中，MNV陽性小鼠主要來自實驗設(shè)施（30.94%），商業(yè)供應(yīng)小鼠感染率為0.27%［21］。MNV在小鼠群體中易感可能與其傳播途徑及持續(xù)感染有關(guān)。除實驗室小鼠感染的MNV外，有研究人員自野生嚙齒類動物中分離得到MNV，該病毒與小家鼠及實驗室小鼠感染的MNV在基因水平相似，但全基因組的差異較大，約為22%～23%，且MNV具有久遠(yuǎn)的感染起源，其感染與種屬特異性相關(guān)［22］。

1.3鼠諾如病毒的感染特征

小鼠經(jīng)口感染MNV后可持續(xù)通過糞便向外排毒，在感染7 d至8周均可檢測到病毒核酸，具有較強(qiáng)的持續(xù)性感染，污染設(shè)施很難通過檢測和淘汰清除MNV［23］。Goto等［24］在對實驗感染和自發(fā)感染MNV的小鼠進(jìn)行檢測時，采集小鼠不同部位樣品，發(fā)現(xiàn)盲腸、糞便、十二指腸、肝臟和脾臟中均可分離出MNV，但心臟、腎臟、肺、唾液腺、卵巢、胸腺、子宮樣品中均未檢測到MNV，其中以盲腸和糞便為檢測MNV的最佳樣品。此外，在陽性孕鼠胚胎（18 d）中未發(fā)現(xiàn)MNV感染，表明剖宮產(chǎn)可能是根除MNV的有效措施。

2　鼠諾如病毒免疫學(xué)研究

目前尚無明確證據(jù)表明MNV感染會對小鼠實驗研究造成干擾，但研究［8］表明MNV-1可致一些固有免疫缺陷小鼠（STAT1-/-, STAT1-/-/PKR-/-, RAG-/-/STAT-/-）腹瀉或死亡, 而干擾素受體缺失（IFNαβγ-/-）小鼠感染后出現(xiàn)高致死性。MNV感染正常小鼠后無臨床癥狀［14］，但該病毒可能對小鼠機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生影響。研究表明［25］，MNV、小鼠細(xì)小病毒（mouse parvovirus，MPV）共感染與單純MPV感染相比，其糞便排毒（MPV）時間延長1周，且共感染BALB/c小鼠腸系膜淋巴結(jié)與脾臟中MPV DNA含量更高。研究MNV對小鼠腸道樹突狀細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)［26］, MNV感染可使腸道固有層（lamina propria, LP）、派伊爾氏斑（Peyer's patch, PP）及腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph node, MLN）中cDCs （conventional DCs）數(shù)量下降, 靠近小腸末端1/3處下降最明顯。由于MNV易感染鼠巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞, 且能在這些細(xì)胞中復(fù)制, 因此MNV感染后cDCs數(shù)量下降可能與細(xì)胞死亡有關(guān)。體外感染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7表明MNV感染可致細(xì)胞病變或死亡［3］, 這些數(shù)據(jù)均表明MNV感染對免疫系統(tǒng)有一定影響。2.1鼠諾如病毒感染通路

人類諾如病毒以組織血型抗原（histo-blood group antigens, HBGAs）為受體, 且這些碳水化合物的特異性是依品系而異的［27］。目前有研究表明［28］, IV和VI基因型犬諾如病毒可與組織血型抗原相互作用。與人類諾如病毒相似, MNV同樣以品系依賴的方式結(jié)合糖脂或糖蛋白末端基團(tuán)［29］。研究表明［30］,小鼠巨噬細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷酯末端的唾液酸基團(tuán)有作為MNV結(jié)合受體的作用。MNV-1和S99結(jié)合鼠巨噬細(xì)胞主要是通過神經(jīng)節(jié)苷酯GD1a末端的唾液酸殘基（sialic acid, SA）、N連接或O連接糖蛋白，而CR3結(jié)合鼠巨噬細(xì)胞僅需N連接的糖蛋白。利用反向遺傳學(xué)方法對MNV-1衣殼蛋白多糖結(jié)合位點進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與人類諾如病毒株VA387結(jié)合HBGA位點的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似［29］，這表明MNV病毒株主要通過結(jié)合巨噬細(xì)胞表面不同多糖受體的方式進(jìn)入鼠巨噬細(xì)胞。此外, 不同MNV病毒株結(jié)合多糖基團(tuán)的差異（N連接或O連接）可能對病毒株產(chǎn)生急性感染（MNV-1）或持續(xù)性感染（CR3）有一定影響。以小鼠腸道極性上皮細(xì)胞（mICcl2）建立濾泡相關(guān)上皮模型系統(tǒng)進(jìn)行體外實驗，研究MNV與小腸相互作用，結(jié)果表明MNV穿過單層極性細(xì)胞是通過M（microfold）樣細(xì)胞進(jìn)行的，在此過程中，MNV不進(jìn)行復(fù)制，也不破壞細(xì)胞間的緊密連接。在細(xì)胞培養(yǎng)時加入B骨髓瘤細(xì)胞不能改變M樣細(xì)胞的數(shù)目，但可以增強(qiáng)M樣細(xì)胞的胞轉(zhuǎn)活性，提示M樣細(xì)胞可能是MNV侵襲宿主的通路［19］。2.2鼠諾如病毒相關(guān)免疫應(yīng)答

MNV感染后，CD4和CD8 T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體都參與MNV的清除［31］，但其亞基因組RNA編碼的VF1蛋白對固有免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制作用，且MNV核心亞基因組RNA含有穩(wěn)定、保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而直接精準(zhǔn)地啟動RNA合成［32］。MNV在免疫活性小鼠體內(nèi)不引起致死性感染，缺少I型和II型干擾素（IFN）受體及下游STAT1的小鼠則高度易感，且免疫缺陷小鼠MNV復(fù)制水平更高［31］。Nice等［33］研究表明，雖然細(xì)胞因子IFN-α 和IFN-β可以預(yù)防鼠諾如病毒的系統(tǒng)性傳播，但只有IFN-λ可以控制腸道病毒感染。鼠諾如病毒衣殼蛋白可刺激IFN-λ的產(chǎn)生，而IFN-λ可在抑制腸道病毒持續(xù)性感染中發(fā)揮重要作用。人諾如病毒研究表明，衣殼蛋白P顆粒就可以有效誘導(dǎo)固有免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫［34］。與人類諾如病毒相似，MNV衣殼蛋白P結(jié)構(gòu)域在病毒復(fù)制和致病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，僅P結(jié)構(gòu)域便足以使病毒在體內(nèi)復(fù)制和致?。?1］。有報道［35］顯示，隨著RAW264.7細(xì)胞傳代，MNV VP1第296個氨基酸的突變（K/E）可引起MNV-1 在STAT1-/-小鼠體內(nèi)毒力減弱，這一突變可能影響其與受體結(jié)合的親和力或特異性，也可能對MNV-1造成持續(xù)性或系統(tǒng)性感染產(chǎn)生影響。在此過程中，NS4第11位氨基酸的突變（V/I）可能發(fā)揮輔助作用。此外，有研究表明，P2亞結(jié)構(gòu)域在病毒產(chǎn)生致死作用中發(fā)揮必不可少的作用［31］。

腸道MNV感染主要引起腸粘膜強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答，MNV特異性CD8T細(xì)胞動態(tài)調(diào)節(jié)與活化、分化和歸巢有關(guān)表面分子的表達(dá)。MNV特異性CD8T細(xì)胞能降低持續(xù)感染的RAG 1-/-小鼠的病毒載量, 表明這些細(xì)胞是參與諾如病毒免疫的重要組分。與MNV急性感染相比, 慢性感染只引起數(shù)量較少、功能較弱的CD8T細(xì)胞產(chǎn)生作用，這些差異在感染8 d后就可顯現(xiàn)出來，提示持續(xù)的腸道諾如病毒感染與病毒特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答功能不佳有關(guān)［36］。

研究表明M NV感染引起細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是通過細(xì)胞色素C釋放、caspase 3和caspase9活化、DNA斷裂來完成的。半胱氨酸蛋白酶的活化發(fā)生在MNV感染2 h后，隨后出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。此外，MNV感染后另一種組織蛋白酶（cathhepsin B）也被活化，病毒還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來延長病毒復(fù)制時間［37］。

每2～3年就會有新型諾如病毒出現(xiàn)，很大程度上是由于病毒衣殼蛋白的易變性使其逃脫抗體的中和作用和機(jī)體的其他免疫作用［38］。MNV在正常小鼠體內(nèi)持續(xù)無癥狀感染可能會導(dǎo)致新型諾如病毒出現(xiàn)所需的基因突變積累，從而促進(jìn)新型諾如病毒的出現(xiàn)［14］。研究表明，MNV-1 P結(jié)構(gòu)域靈活、易發(fā)生突變，蛋白表面暴露的E'-F'環(huán)狀結(jié)構(gòu)突變使MNV-1逃脫抗體的中和作用［38］。

3　鼠諾如病毒的檢測方法

鼠諾如病毒作為實驗小鼠中流行最廣泛的病原體，對實驗小鼠的免疫系統(tǒng)可能存在潛在影響，為確保實驗小鼠的微生物質(zhì)量，提高實驗數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性，加強(qiáng)鼠源性生物制品的質(zhì)量控制，有關(guān)鼠諾如病毒的檢測方法也在逐步發(fā)展和完善。

3.1電鏡法

電鏡法是早期檢測諾如病毒的方法，由于隱藏在糞便樣品中的病毒顆粒數(shù)有限，使得電子顯微鏡的檢測能力非常有限。此外，電子顯微鏡檢測靈敏度受實驗人員操作熟練程度的影響，且價格昂貴，不適于對大樣本進(jìn)行MNV檢測。

3.2血清學(xué)方法

諾如病毒P顆?？筛咝б痼w液和細(xì)胞免疫，且衣殼蛋白易在大腸桿菌感受態(tài)得到表達(dá)，這使血清學(xué)方法成為MNV檢測的有效途徑［34］。人類諾如病毒研究表明，在桿狀病毒sf9細(xì)胞中表達(dá)ORF2后，表達(dá)產(chǎn)物可自動組裝成病毒樣顆粒（Virus-like particles），其形態(tài)、大小、抗原性都與完整的病毒顆粒相似，免疫活性與自然毒株相似，具有完備的翻譯后修飾，可進(jìn)行高效表達(dá)。利用大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)ORF2，其產(chǎn)物具有與真核表達(dá)同樣的抗原性和抗體吸附特異性。原核表達(dá)的可溶性衣殼蛋白免疫得到的抗體可識別衣殼蛋白各區(qū)，包括N端和C端，其抗原表位主要來自N端的40個氨基酸，利用諾如病毒衣殼蛋白高度保守的N端制備抗體，一定程度上解決了諾如病毒變異大和同一基因型但血清型存在差異的問題，產(chǎn)生的抗體具有廣泛的免疫識別能力，但原核表達(dá)的衣殼蛋白缺乏翻譯后修飾，且原核表達(dá)有時易形成包涵體。此外，還有報道在腺病毒中進(jìn)行表達(dá)ORF2，這種方法抗原制備快、安全、不需要純化、滴度高，且免疫時不需要佐劑，免疫方式簡單，但重組蛋白可能攜帶宿主基因［39］。血清學(xué)方法以免疫熒光分析（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）為主。我國目前有關(guān)于MNV-1表達(dá)和相應(yīng)的IFA、ELISA以及廣州分離株IFA方法建立的報道［21,16］，國外有關(guān)于多重免疫熒光分析（MFI）檢測方法的報道。

3.3RT-PCR

2005年Hus等［40］報道了可以采用RT-PCR檢測MNV-1, 并表明該法檢測到實驗感染小鼠MNV 5周后可在小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、空腸等處檢測到MNV RNA。 Goto等［24］建立了MNV檢測的巢式RT-PCR方法，但這種方法也只能檢測到MNV1、2、3、4分離株。隨后, Kitajima等［41］建立了新的巢式RT-PCR方法，該法可檢測42個MNV分離株，檢測范圍大大增加，其敏感性更高?；谇叭说难芯浚紤]到常規(guī)巢式RT-PCR要求待檢樣品中含有較高載量的病毒量， Tajima等［42］構(gòu)建了新的MNV特異性巢式RT-PCR引物, 該法降低了引物與其他病原體的錯配，提高了檢測方法的靈敏性和特異性。但常規(guī)的RT-PCR方法檢測MNV都需在感染一周后才能得到較好的效果［43］。

3.4熒光定量PCR

Kitajima等［44］對44種MNV分離株進(jìn)行全基因組序列分析后，選取保守序列設(shè)計引物和探針，建立熒光定量PCR，靈敏度高，檢測限為1.0× 102，定量范圍為102～108。針對MNV各分離株保守序列建立熒光定量PCR可有效解決基因組序列多樣性的問題。Hanaki等［45］也基于MNV分離株全基因組序列比對，篩選高度保守序列，建立SYBR Green I Real-Time RT-PCR方法，該法同樣比對了44個MNV分離株。目前Pubmed 上公布的MNV分離株全基因組序列已有60株，且MNV分離株間核酸序列有一定差異，因此，有必要建立更為廣譜的方法以快速、高效、全面地檢測MNV在小鼠及鼠源性生物制品中的感染情況。

3.5高通量微流控系統(tǒng)

Fischer 等［14］建立了高通量微流控系統(tǒng)用于研究高突變率和增殖周期短的RNA病毒，這是采用高通量技術(shù)培養(yǎng)和分析病毒表型的新方法，能有效研究病毒進(jìn)化過程。該方法采用油包水微流控系統(tǒng)，將MNV與單個RAW264.7細(xì)胞共密封于液滴中，可通過一系列點突變評估MNV逃避中和抗體的能力，也可用于分離逃避進(jìn)化壓力的其他突變體。

4　小結(jié)與展望

鼠諾如病毒的分離及檢測方法的建立為MNV感染狀況的研究提供了必要基礎(chǔ)，也為無MNV感染鼠群的建立提供了幫助。本實驗室分離的BJ10-2062 MNV分離株［17］可能對了解北京地區(qū)MNV感染情況更具代表性。由于MNV對小鼠微生物質(zhì)量及實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響，因此，加強(qiáng)對小鼠及相關(guān)生物制品諾如病毒感染的檢測非常必要。

動物和人的NVs密切相關(guān)，特別是豬的NVs屬于與人諾如病毒相同的基因亞型（GII），且有研究證實人NVs GII在無菌級豬體內(nèi)能進(jìn)行增殖，認(rèn)為動物宿主和人獸共患傳播可能存在，但基因的距離和受體的差異使該假說難被認(rèn)同［46］。Widdowson等［47］也報道雖然動物NVs尚未從人體中分離出來，但人一旦感染GIII屬中的NVs，便會產(chǎn)生GIII.2抗體，認(rèn)為可能是人和豬NVs抗原表位的交叉反應(yīng)引起。目前，已有研究證實NVs重組體與豬、牛和人等物種中檢測到的NVs有相同基因型［48］。此外，人自然地感染GI和GII型NVs，而且在貝殼中發(fā)現(xiàn)人和動物的NVs同時存在［49］?，F(xiàn)有報道稱，與人諾如病毒相似，犬諾如病毒的受體同樣為組織血型抗原［28］。這些發(fā)現(xiàn)為研究諾如病毒的進(jìn)化發(fā)展提供了基礎(chǔ)，同時也大大增加了人與人、人與動物間NVs的感染風(fēng)險，促進(jìn)新病毒的重組和發(fā)現(xiàn)，也為諾如病毒在異種物種間的傳播提供了可能［50］，諾如病毒的預(yù)防和控制就更需引起重視。目前，有關(guān)諾如病毒感染、致病機(jī)制，病毒與宿主相互作用及病毒復(fù)制機(jī)制等基礎(chǔ)研究相對薄弱，未來這些研究方向都將促進(jìn)人們對諾如病毒的了解，以期為人類諾如病毒的預(yù)防和控制貢獻(xiàn)力量。

Kernbauer 等［51］在歷時兩年完成的一系列小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)，感染常見小鼠諾如病毒可幫助小鼠修復(fù)炎癥造成的組織損傷，在抗生素治療消滅微生物組后MNV可幫助恢復(fù)腸道的免疫防御。Baldridge等［33］研究顯示，腸道微生物的存在有利于諾如病毒的持續(xù)性感染。這些研究表明小鼠腸道中病毒和細(xì)菌之間的相互支持關(guān)系，并為進(jìn)一步研究病毒組支持免疫系統(tǒng)的確切機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，他們認(rèn)為這可能也適用于人類。

目前還沒有建立HunoVs體外培養(yǎng)體系，且諾如病毒高度變異，這使得HuNoVs疫苗的研究始終沒有大的突破，因此對HunoVs尚無有效的預(yù)防和控制方法。北京市疾控中心報道［52］，我國多省均出現(xiàn)諾如病毒流行，2015年1月到3月期間，北京市共報道諾如病毒聚集性疫情21起，其中爆發(fā)疫情7起。鼠諾如病毒作為唯一可在體外培養(yǎng)的諾如病毒，對于研究HuNoVs的免疫機(jī)制、抗病毒制劑的研究有重要意義。

此外，MNV作為實驗小鼠常見感染因子之一，其預(yù)防和控制對于保障實驗動物微生物質(zhì)量和加強(qiáng)鼠源性生物制品的質(zhì)量控制具有重要意義。同時，作為目前為止可替代正常菌群的腸道RNA病毒，其應(yīng)用前景備受期待。

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Research Progress of Murine Norovirus in Characteristics，Immunology and Detection Methods

GAO Jie, HE Zheng-ming
（Laboratory Animal Institute， National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

Murine norovirus （MNV） is the only norovirus that can be cultivated in vitro. The isolation of the strains and its successful proliferation in the mouse macrophage RAW264.7 cell lay the foundation for molecular mechanism research of norovirus, which also provide help for the pathogenic mechanism research and preparation of vaccine of human norovirus （HuNoVs）. MNV is one of the most widely spread infection factors in mice. The replication of murine norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. The virus can make lethal effect on immune-deficient mice. It's of great significance to strengthen the control of the virus infection.

Murine norovirus； Characteristics； Mechanism； Detection

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0414-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.016

2014-12-15

國家科技支撐課題（2013BAK11B01）

高潔（1990-）, 女, 碩士, 研究方向： 實驗動物病毒學(xué)。E-mail： gaojieru@163.com

賀爭鳴（1957-）, 男, 研究員, 博士, 研究方向： 實驗動物微生物學(xué), E-mail： hezm@nifdc.org.cn