白 泉

(西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所, 現(xiàn)代分離科學(xué)陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710069)

聚 焦

近期色譜研究的最新動(dòng)態(tài)和進(jìn)展

白 泉*

(西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所, 現(xiàn)代分離科學(xué)陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710069)

色譜是復(fù)雜樣品分離分析的重要手段。當(dāng)前復(fù)雜樣品的分析對(duì)分離科學(xué)提出了越來越高的要求,而發(fā)展新型高效分離材料、分離模式和高靈敏度的檢測(cè)方法是解決該問題的有效途徑之一。本文依據(jù)2015年6至8月AnalyticalChemistry新錄用和在線發(fā)表的有關(guān)論文,討論色譜在樣品前處理、固定相、手性拆分、分析檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的最新研究動(dòng)態(tài)和進(jìn)展。

1 樣品前處理

樣品前處理是分析過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié),直接影響著分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。膜蛋白的疏水性強(qiáng)、溶解性差和豐度低,對(duì)它的分離分析是蛋白質(zhì)組學(xué)中的一大難題。復(fù)旦大學(xué)的劉寶紅教授課題組[1]采用殼聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作為納米反應(yīng)器，從有機(jī)溶劑中高效富集疏水性膜蛋白并進(jìn)行原位酶解。將該技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際樣品中膜蛋白的分析鑒定,采用二維液相色譜-質(zhì)譜方法(2D-LC-MS)可鑒定931種膜蛋白,而通常采用的水溶液中酶解法僅能鑒定73種膜蛋白。結(jié)果表明多功能的MGF-CS對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中膜蛋白的分析鑒定具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

分子印跡技術(shù)是采用人工合成方法制備對(duì)目標(biāo)分子有特異性識(shí)別材料的技術(shù)。目前針對(duì)有機(jī)小分子和金屬離子的印跡工作已取得了巨大進(jìn)展。由于蛋白質(zhì)體積大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易于變性,完整蛋白質(zhì)模板分子難以獲得且價(jià)格昂貴,因此限制了蛋白質(zhì)分子印跡材料的發(fā)展。中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張麗華研究員課題組[2]提出了一種蛋白質(zhì)抗原決定基分子印跡磁性納米材料的制備新方法。抗原決定基印跡是以目標(biāo)蛋白質(zhì)上一段特異性多肽為模板分子進(jìn)行印跡。由于模板肽段與目標(biāo)蛋白質(zhì)間存在極強(qiáng)的特異性,形成的印跡位點(diǎn)對(duì)模板肽段及目標(biāo)蛋白質(zhì)均具有特異性識(shí)別能力。首先在SiO2包覆的磁性Fe3O4納米粒子表面通過化學(xué)修飾引入亞氨基二乙酸(IDA)基團(tuán)。利用IDA與Ni2+的螯合作用,將Ni2+固載在基質(zhì)材料(Fe3O4@SiO2@IDA@Ni2+)表面;然后加入末端修飾有組氨酸標(biāo)簽的模板肽段溶液,使模板通過與Ni2+的螯合作用固載于基質(zhì)表面;隨后按一定的質(zhì)量比在上述固載模板的基質(zhì)材料中加入功能單體多巴胺,在弱堿性條件下進(jìn)行自聚合形成分子印跡層,制備出核-殼型復(fù)合納米粒子,可通過單體的用量控制殼層厚度;聚合完成后,反復(fù)用200 mmol/L EDTA-2Na水溶液清洗聚合物材料,使其中的模板分子洗脫出來,進(jìn)而得到抗原決定基分子印跡材料。該表面分子印跡納米材料對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)具有很好的選擇性識(shí)別作用。該制備方法不僅解決了蛋白質(zhì)分子印跡中蛋白質(zhì)難以獲得、價(jià)格昂貴的問題,同時(shí)多肽模板構(gòu)象穩(wěn)定,增加了印跡位點(diǎn)識(shí)別的特異性。通過金屬螯合作用將模板多肽固載于基質(zhì)表面,大大提高了模板的利用率。該方法對(duì)制備不同目標(biāo)蛋白質(zhì)抗原決定基印跡材料具有通用性和普適性。

金屬有機(jī)骨架化合物(metal-organic frameworks, MOFs)因具有比表面積大、結(jié)構(gòu)多樣性、孔道尺寸可調(diào)、骨架可修飾、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于分離分析等領(lǐng)域。西班牙Balearic Islands大學(xué)的Palomino課題組[3]利用注射器設(shè)計(jì)了一種針管式自動(dòng)磁性MOFs分散固相微萃取裝置。首先將10 mg磁性MOFs材料Fe3O4@MIL-100(Cr)和一個(gè)磁子置于5 mL針管內(nèi)。該針管類似于一個(gè)雙向的注射泵。以高流速將樣品溶液從針頭處加入針管內(nèi),使MOFs材料完全分散于樣品溶液中。在攪拌過程中選擇性吸附樣品的磁性MOFs納米顆粒逐漸吸附于磁子上?？梢酝ㄟ^控制磁子的磁性釋放和回收磁性MOFs納米粒子。待吸附完全,推動(dòng)注射器的活塞桿將溶液擠出。再按上述方法用水多次充分洗滌MOFs納米吸附劑,最后用洗脫劑洗脫樣品后進(jìn)行檢測(cè)。該裝置設(shè)計(jì)巧妙,簡(jiǎn)單易行,便于與檢測(cè)器或分離裝置連接。將其應(yīng)用于各種水樣和魚樣中孔雀石綠的分析檢測(cè),檢出限達(dá)到0.012 mg/L,線性范圍為0.04～2 mg/L。

澳大利亞Bahauddin Zakariya大學(xué)的Najiam-ul-Haq課題組[4]構(gòu)建了一種磁性氧化鑭和氧化釤核-殼納米粒子(Fe3O4@SiO2-La2O3和Fe3O4@SiO2-Sm2O3),成功地用于各種酪蛋白、脫脂牛奶、蛋黃、人血清和Hela細(xì)胞提取物中磷酸化肽和磷酸化蛋白質(zhì)的富集。該吸附材料幾乎沒有不可逆吸附,在8 500倍的非磷酸化蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)背景溶液中對(duì)β-酪蛋白仍表現(xiàn)出了非常高的選擇性,靈敏度可達(dá)到attomole (10-18mol)級(jí),重現(xiàn)性好,在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中具有很好的應(yīng)用前景。

2 固定相

多孔整體材料作為一種新型分離介質(zhì),由于其具有制備簡(jiǎn)便、通透性好、性能穩(wěn)定和易于修飾等特點(diǎn)而被譽(yù)為第四代色譜分離介質(zhì)。鄒漢法課題組[5]發(fā)展了一種基于光引發(fā)巰基-丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)的新方法,并成功制備了具有高分離性能的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。與巰基-烯和巰基-甲基丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)相似,光引發(fā)的巰基-丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)不僅反應(yīng)效率較高,速度快(通常10 min內(nèi)即可完成),而且反應(yīng)條件非常溫和。所制備的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的微觀結(jié)構(gòu)非常均一、規(guī)整,并且具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。將其應(yīng)用于毛細(xì)管液相色譜,柱效高達(dá)73 500 N/m,實(shí)現(xiàn)了對(duì)苯系物、苯酚類、苯胺類等小分子化合物的高效分離。此外,所制備的整體柱對(duì)16種多環(huán)芳烴PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)物(EPA 610)和蛋白質(zhì)酶解液等一些復(fù)雜的環(huán)境和生物樣品也具有較好的分離能力。表明采用巰基-丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)可以有效制備出具有高效分離能力的新型毛細(xì)管有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

加拿大卡爾加里大學(xué)的Thurbide小組[6]將316不銹鋼粉末(粒徑44～149 μm)填充于316不銹鋼毛細(xì)管柱內(nèi)作為支持體,將水泵入色譜柱中,建立了以水為固定相,CO2為流動(dòng)相,與火焰離子化檢測(cè)器聯(lián)用的超臨界流體色譜分離體系(SFC-FID)。該體系可在一定的溫度和壓力范圍內(nèi)進(jìn)行操作。樣品保留時(shí)間的重現(xiàn)性良好(RSD≤2.6%)。與不銹鋼毛細(xì)管直接用水涂層作為固定相相比,這種用不銹鋼粉末填充柱的方法不僅可以保持良好的色譜峰形和高柱效,還可使分離速度提高10倍,保留因子提高約8倍,樣品量提高20倍。

3 手性拆分

德國(guó)萊比錫城大學(xué)的Belder小組[7]將纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)包覆的5 μm全多孔SiO2手性固定相填充于微流控芯片的通道中,第一次利用填充的微流控芯片(柱長(zhǎng)58.4 mm)實(shí)現(xiàn)了幾種手性藥物的快速拆分,對(duì)力莫敵提取物在5 s內(nèi)就可完成拆分。

法國(guó)Grenoble Alpes大學(xué)的Peyrin小組[8]利用毛細(xì)管電泳研究了任意選擇的10種具有不同堿基組成、大小、長(zhǎng)度和二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸作為手性試劑時(shí)對(duì)手性化合物的拆分能力。作者采用將寡核苷酸部分填充于毛細(xì)管柱的方式,對(duì)24種手性化合物進(jìn)行了拆分。研究結(jié)果表明所選擇的寡核苷酸對(duì)芳香族小分子化合物都表現(xiàn)出了一定的手性拆分能力。在mmol/L DNA條件下,僅用3種寡核苷酸就可拆分包括藥品、毒品、氨基酸和核苷等在內(nèi)的21種芳香族手性化合物。這一研究結(jié)果表明發(fā)展基于核酸的手性拆分方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 分析檢測(cè)

澳大利亞悉尼大學(xué)的Handelsman小組[9]采用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯(1,2-dimethylimidazole-5-sulfonyl chloride)作為雌激素衍生化試劑,建立了一種利用LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定血清中衍生化的雌二醇(E2)和未衍生化的睪酮(T)、二氫睪酮(DHT)的高靈敏檢測(cè)方法。該衍生化試劑可與雌二醇的酚羥基反應(yīng),在質(zhì)譜分析中可高靈敏度地檢測(cè)到質(zhì)量增加片段。E2、T和DHT的檢出限分別為0.5 pg/mL、25 pg/mL和0.10 ng/mL。

隨著納米材料科學(xué)的發(fā)展,金屬納米粒子的檢測(cè)引起相當(dāng)大的關(guān)注。中國(guó)地質(zhì)大學(xué)的Zhu等[10]采用一種耦合薄層色譜和激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(TCL-LA-ICP-MS)技術(shù)對(duì)水懸浮液中的納米金進(jìn)行定量表征分離。該方法已成功地應(yīng)用于定量表征金納米粒子大小(13、41和100 nm)的薄層色譜分離過程,實(shí)現(xiàn)了不同粒徑納米金的測(cè)定。

5 蛋白質(zhì)組學(xué)

多維液相色譜(MDLC)為自上而下蛋白質(zhì)組學(xué)研究中整體蛋白質(zhì)的分離提供了有力工具。但是二維液相色譜(2DLC)卻無法滿足蛋白質(zhì)組學(xué)復(fù)雜樣品中整體蛋白質(zhì)分離的需要。美國(guó)Wisconsin-Madison大學(xué)的Ge小組[11]耦合離子交換色譜/疏水色譜/反相色譜(IEC-HIC-RPC)3種色譜分離方法,構(gòu)建了三維液相色譜(3DLC)用于整體蛋白質(zhì)的分離,并證明3DLC(IEC-HIC-RPC)技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的2DLC(IEC-RPC)。對(duì)于HEK293細(xì)胞裂解液,前者可鑒定640種蛋白質(zhì),而后者只能鑒定出47種。結(jié)果表明3DLC技術(shù)在自上而下蛋白質(zhì)組學(xué)中對(duì)整體蛋白質(zhì)的分離具有很好的應(yīng)用前景。

蛋白質(zhì)的磷酸化一直是功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)。美國(guó)PolyLC公司的Alpert等[12]比較了靜電排斥親水色譜(ERLIC)和陰離子交換色譜(AEX)兩種分離模式在不同pH條件下對(duì)磷酸化肽分離的優(yōu)劣。在pH>5時(shí),磷酸化肽帶有2個(gè)負(fù)電荷,可在AEX柱上保留,但是帶有1個(gè)或2個(gè)磷酸基團(tuán)的肽卻無法與含有多個(gè)精氨酸和谷氨酸殘基的多肽分離,從而干擾磷酸化肽的鑒定。在pH=2時(shí),磷酸化殘基僅帶一個(gè)負(fù)電荷,而精氨酸和谷氨酸殘基不帶電荷,有利于磷酸化肽從未被修飾的酸性多肽中分離。在此條件下,單磷酸化肽基于靜電排斥作用在ERLIC模式下有弱保留。比較AEX和ERLIC兩種分離模式對(duì)Hela細(xì)胞胰蛋白酶酶解物的分離,ERLIC模式可分離鑒定12 467種磷酸化肽,其中包括4 233種多個(gè)磷酸修飾的肽段。而AEX模式只能鑒定其中的60%。研究結(jié)果表明,在低pH條件下,ERLIC模式是對(duì)磷酸化肽分離鑒定的最好方法,為磷酸化肽的分離鑒定提供了新思路。

[1] Fang X N, Qiao L, Yan G Q, et al. Anal Chem, 2015, 87: 9360

[2] Li S W, Yang K G, Liu J X, et al. Anal Chem, 2015, 87: 4617

[3] Maya F, Cabello C P, Estela J M, et al. Anal Chem, 2015, 87: 7545

[4] Jabeen F, Najam-ul-Haq M, Rainer M, et al. Anal Chem, 2015, 87: 4726

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[6] Murakami J N, Thurbide K B. Anal Chem, 2015, 87: 9429

[7] Thurmann S, Lotter C, Heiland J J, et al. Anal Chem, 2015, 87: 5568

[8] Tohala L, Oukacine F, Ravelet C, et al. Anal Chem, 2015, 87: 5491

[9] Keski-Rahkonen P, Desai R, Jimenez M, et al. Anal Chem, 2015, 87: 7180

[10] Yan N, Zhu Z L, Jin L L, et al. Anal Chem, 2015, 87: 6079

[11] Valeja S G, Xiu L C, Gregorich Z R, et al. Anal Chem, 2015, 87: 5363

[12] Alpert A J, Hudecz O, Mechtler K, et al. Anal Chem, 2015, 87: 4704

《色譜》主編張玉奎院士榮獲色譜終生成就獎(jiǎng)

9月22日,在北京召開的第43屆國(guó)際高效液相色譜及相關(guān)技術(shù)會(huì)議(HPLC 2015, Beijing)上,經(jīng)中國(guó)色譜學(xué)會(huì)推薦,HPLC科學(xué)委員會(huì)常委批準(zhǔn),大會(huì)向張玉奎院士頒發(fā)了色譜終生成就獎(jiǎng)。

《色譜》主編張玉奎院士于1965年畢業(yè)于南開大學(xué)化學(xué)系,1965年至今在中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所工作;兼任國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展研究(973)領(lǐng)域咨詢專家組成員、重大科學(xué)研究計(jì)劃專家組成員、中國(guó)分析測(cè)試協(xié)會(huì)副理事長(zhǎng)、中國(guó)化學(xué)會(huì)色譜專業(yè)委員會(huì)主任、Anal Chem等雜志編委;目前已發(fā)表SCI論文近500篇,并申請(qǐng)100余項(xiàng)發(fā)明專利;曾獲國(guó)家自然科學(xué)二等獎(jiǎng)、遼寧省自然科學(xué)一等獎(jiǎng)等獎(jiǎng)項(xiàng)。

張玉奎院士長(zhǎng)期致力于色譜基本理論和新技術(shù)、新方法的研究,為推動(dòng)色譜學(xué)科的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn),在色譜熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)和專家系統(tǒng)等方面均取得了突出成就;在深入理論研究的基礎(chǔ)上,還注重完成國(guó)家任務(wù)與儀器的應(yīng)用開發(fā),實(shí)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)色譜儀器及相關(guān)部件的產(chǎn)業(yè)化;近年來,根據(jù)分析化學(xué)和國(guó)際前沿研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì),結(jié)合國(guó)家重大應(yīng)用領(lǐng)域的需求,放眼于分析學(xué)科與生命學(xué)科的交叉發(fā)展,著重開展蛋白質(zhì)組高效分離與高靈敏檢測(cè)的研究;在科學(xué)研究同時(shí),堅(jiān)持以人為本的原則,高度重視人才培養(yǎng),目前已培養(yǎng)博士后和博士50余名,均已在我國(guó)分析科學(xué)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究、應(yīng)用開發(fā)以及儀器產(chǎn)業(yè)化等方面發(fā)揮著重要的作用。

李瀟、侯春彥 供稿

10.3724/SP.J.1123.2015.10006

2015-10-08

*通訊聯(lián)系人.E-mail:baiquan@nwu.edu.cn.