寇蕓蕓，陳新，王旭，林棟，孫維礦，劉梁

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

花椒提取物的殺蟲活性研究

寇蕓蕓，陳新*，王旭，林棟，孫維礦，劉梁

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

以花椒果皮為研究對象，赤擬谷盜為供試蟲源，采用點滴法、飼喂法、三角瓶密閉熏蒸法和培養(yǎng)皿濾紙涂藥法檢測不同花椒果皮提取物對赤擬谷盜的的觸殺、胃毒、熏蒸及趨避作用。實驗結(jié)果顯示，正丁醇萃取部分對赤擬谷盜的觸殺活性最高，其LC50值為1.086 463 g/mL，石油醚提取部分對赤擬谷盜趨避活性最高，其趨避率可達到93.617%，花椒果皮不同極性段的提取物均有一定的殺蟲活性。

花椒果皮；殺蟲活性；赤擬谷盜

赤擬谷盜（tribolium castaneum），屬鞘翅目擬步甲科，是一種重要的世界儲糧害蟲[1]。其不僅對稻谷、小麥、玉米等多種糧食在儲藏過程中造成嚴重危害，而且其成蟲身上的臭腺分泌物易使面粉結(jié)塊，變色變味，不能食用，其分泌物還含有致癌物苯[2]。目前，人們對赤擬谷盜仍然以化學防治為主，但過度的依賴化學防治引起嚴重的“3R”現(xiàn)象及對生態(tài)環(huán)境的干擾等負面影響已迫使人們尋找非化學的、對環(huán)境友好的可替代的防治方式[3]。由于植物源殺蟲劑具有選擇性強、對害蟲天敵和人畜毒性低、與環(huán)境有較高的和諧度、在自然環(huán)境下易分解，殘留量低、作用方式獨特，而且害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點，近年來已成為國內(nèi)外害蟲防治領(lǐng)域的一個研究熱點[4-10]?；ń窞槭|香科花椒屬植物，目前證實花椒屬植物中含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺類、木脂素、脂肪酸等活性成分[10-13]除了作為日常的調(diào)料和香料外，中醫(yī)中還記載花椒具有“溫中止痛，殺蟲止癢”的作用[13-17]。

本研究分別以石油醚、80%乙醇、甲醇為溶劑，采用超聲波輔助萃取法提取花椒中的活性成分，系統(tǒng)研究不同極性溶劑花椒提取物對赤擬谷盜的觸殺、胃毒、熏蒸及趨避作用[18]為進一步開發(fā)利用植物殺蟲劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

赤擬谷盜寄生于米糠中，米糠置于室溫為（28± 1）℃，濕度（56±5）%，光照時間為12 h環(huán)境下。米糠由湖北洪森實業(yè)（集團）有限公司提供，赤擬谷盜由武漢輕工大學生物活性成分研究室培養(yǎng)提供。

1.2 供試植物

花椒果皮，來源于蕓香科花椒屬植物花椒的果皮，本實驗花椒果皮購買于市場上。

1.3 主要試劑

無水乙醇，乙醚，甲醇，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，氯仿，濃鹽酸，氨水，無水硫酸鈉等。

1.4 主要設備及儀器

培養(yǎng)皿，移液器，分液漏斗，分析天平，pH試紙，超聲震蕩儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.5 方法

1.5.1 花椒殺蟲活性物質(zhì)的提取

將花椒粉碎后，稱取200 g，加入石油醚采用超聲提取法提取，每次40min，提取兩次，過濾合并提取液，濃縮得到石油醚提取物浸膏，此浸膏為樣品一，備用。

另稱取花椒粉末200 g，用80%乙醇采用超聲提取法提取，每次40min，提取兩次，過濾合并提取液，濃縮到一定濃度后分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酯萃取部分為樣品二。將正丁醇萃取部分加入檸檬酸調(diào)pH 1～2，用氯仿萃取非堿部分，在水中加氨水調(diào)節(jié)pH 9～10，用氯仿萃取，用無水硫酸鈉干燥氯仿萃取物，無水硫酸鈉干燥24小時后，過濾，得到浸膏，此浸膏為樣品三，備用。

最后稱取花椒粉末200 g，直接使用甲醇采取超聲提取法，每次40min，提取兩次，過濾合并濾液，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 1～2，用氯仿萃出非堿部分，在水中加氨水調(diào)節(jié)pH 9～10，用氯仿萃取，用無水硫酸鈉干燥氯仿萃取物，無水硫酸鈉干燥24 h后，過濾，得到浸膏，此浸膏為樣品四，備用。

將上述所得四個樣品分別用丙酮配制成2 g/m L的溶液，并分別稀釋成1.5、1.0、0.5 g/mL的溶液，備用。

1.5.2 生物測定方法

取不同濃度的不同花椒提取物研究不同花椒提取物的生物活性，以赤擬谷盜為試驗對象，研究不同花椒提取物對赤擬谷盜的觸殺、胃毒性、熏蒸及趨避活性[19-21]。

1.5.2.1 觸殺活性

采用點滴法[22-23]取物對赤擬谷盜的殺蟲活性，將不同濃度的每種花椒提取液用毛細管將約2μL的溶液點滴于赤擬谷盜體背，每種提取液的每個濃度處理50頭，將處理過的赤擬谷盜放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入適量的米糠作為飼料，用紗網(wǎng)蓋好培養(yǎng)皿，每個處理組重復3次。于24、48、72、96 h觀察試蟲死亡情況，每個樣品的每個濃度做3個重復，丙酮作為對照，記錄每個濃度的死亡數(shù)，計算每個濃度平均死亡數(shù)。

1.5.2.2 胃毒活性

采用飼喂法測定花椒提取物對赤擬谷盜的殺蟲活性[24]，將上述所得樣品分別取10mL加入放有人工飼料的培養(yǎng)皿中，旋轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)皿，使得培養(yǎng)皿均勻涂布在固體飼料表面，使固體飼料自然風干，然后將每個培養(yǎng)皿中放入50只赤擬谷盜培養(yǎng)，用紗網(wǎng)蓋好培養(yǎng)皿，于24、48、72、96 h觀察試蟲死亡情況，每個樣品的每個濃度做三個重復，于丙酮作為對照，記錄每個濃度的死亡數(shù)，并求出每個濃度平均死亡數(shù)。

1.5.2.3 密閉熏蒸法[25-27]

在250mL三角瓶中接入50頭赤擬谷盜，加入適量的米糠作為飼料。準備1 cm×6 cm的濾紙條，分別在每個濾紙條上滴1mL的不同濃度的每種花椒提取物，將濾紙粘于三角瓶內(nèi)部，使濾紙距離三角瓶底部2 cm～3 cm，迅速將三角瓶封好，并設置丙酮為空白對照組。處理組每組重復3次，將三角瓶置于室內(nèi)，于24、48、72、96 h觀察試蟲死亡情況，并求出每個濃度的平均死亡數(shù)。

1.5.2.4 趨避活性

采用培養(yǎng)皿濾紙涂藥法[28]測定：將11 cm的濾紙折成兩半，分別將一張濾紙的一邊均勻涂布上1mL的不同濃度的每種花椒提取物，另一邊均勻涂布上相同量的丙酮，用鉛筆做上標記，將處理好的濾紙放入相適應的培養(yǎng)皿中，在每個培養(yǎng)皿中接入50頭赤擬谷盜，用紗網(wǎng)蓋好培養(yǎng)皿，每個處理組重復3次，分別于24、48、72、96 h觀察試蟲在對照邊和處理邊蟲數(shù)。計算不同花椒提取物對赤擬谷盜的趨避活性。

趨避率=（對照蟲數(shù)-處理蟲數(shù)）/對照蟲數(shù)

試蟲死亡標準：試蟲不能取食并用毛筆輕觸試蟲，試蟲不動或者僅有一條腿動即判斷為死亡。

1.5.3 數(shù)據(jù)記錄與處理

試驗中記錄了24、48、72、96 h試蟲的死亡數(shù)，由記錄數(shù)據(jù)可以看出，試蟲培養(yǎng)72小時后試蟲死亡率達到最高水平，因此該實驗研究試蟲72 h死亡數(shù)，實驗中72 h試蟲死亡數(shù)記錄情況如下。

將表1所得的數(shù)據(jù)用用excel軟件求毒力回歸方程[29]50及95%置信限，從結(jié)果表中可以直接看出每組提取物毒力回歸方程及半數(shù)致死濃度等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物對赤擬谷盜的觸殺活性

以不同花椒提取物的不同濃度對赤擬谷盜的觸殺活性進行了初步分析，結(jié)果可見表3。

由表3可以看出不同花椒提取物對赤擬谷盜均有一定的觸殺活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對赤擬谷盜的觸殺活性不斷增加，其中正丁醇萃取酸堿處理部分在對赤擬谷盜72 h處理后，赤擬谷盜的死亡率達到較高水平。

2.2 不同提取物對赤擬谷盜的胃毒活性

以不同花椒提取物的不同濃度對赤擬谷盜的胃毒活性進行了初步分析，結(jié)果可見表4。

由表4可以看出不同花椒提取物對赤擬谷盜均有一定的胃毒活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對赤擬谷盜的胃毒活性不斷增加，在四種不同花椒提取物中，正丁醇萃取酸堿處理部分對對赤擬谷盜的殺死率達到最高水平。

2.3 不同提取物對赤擬谷盜的熏蒸活性

以不同花椒提取物的不同濃度對赤擬谷盜的熏蒸活性進行了初步分析，結(jié)果可見表5。

由表5可以看出不同花椒提取物對赤擬谷盜均有一定的熏蒸活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對赤擬谷盜的熏蒸活性不斷增加，在四種不同花椒提取物中，石油醚提取花椒部分對赤擬谷盜殺死率達到最高水平。

2.4 不同提取物對赤擬谷盜的趨避活性

以不同花椒提取物的不同濃度對赤擬谷盜的趨避活性進行了初步分析，結(jié)果可見表6。

由表6可以看出不同花椒提取物對赤擬谷盜均有一定的趨避活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對赤擬谷盜的趨避活性不斷增加，在四種不同花椒提取物中，石油醚提取花椒部分對赤擬谷盜的趨避活性最好，趨避率達到到93.617%。

3 討論

由實驗數(shù)據(jù)可以看出，不同花椒提取物對赤擬谷盜均有一定的觸殺、胃毒、熏蒸及趨避活性，其中對赤擬谷盜的觸殺活性大小為：正丁醇萃取處理部分>乙酸乙酯萃取部分>石油醚提取部分>甲醇提取處理部分；對赤擬谷盜的胃毒活性大小為：正丁醇萃取處理部分>甲醇提取處理部分>乙酸乙酯萃取部分>石油醚提取部分；對赤擬谷盜熏蒸活性大小為：石油醚提取部分>正丁醇萃取處理部分>甲醇提取處理部分>乙酸乙酯萃取部分；對赤擬谷盜趨避活性大小為：石油醚提取部分>正丁醇萃取處理部分>乙酸乙酯萃取部分>甲醇提取處理部分；且通過比較得出花椒提取物對赤擬谷盜的觸殺活性和趨避活性較好，花椒提取物對赤擬谷盜的觸殺活性達到較高時的LC50值為1.086 463 g/mL，對赤擬谷盜的趨避活性較好時趨避率可達到93.617%。

本實驗可為進一步研究花椒對其他儲糧霉蟲的殺蟲活性以及為研發(fā)儲糧霉蟲殺蟲劑提供技術(shù)參考。并可以進一步提取分離出花椒單體物質(zhì)，對提取出的單體物質(zhì)進行殺蟲活性研究驗證，并對具有殺蟲活性的單體進行結(jié)構(gòu)鑒定，了解花椒主要殺蟲活性成分。

[1] 趙曉俠.花椒的生物活性成分及其應用研究[J].長春大學學報, 2008,18(1):108-110

[2]馬養(yǎng)民,張巧云,朱軍峰.GC-MS分析花椒籽油的脂肪酸組分[J].糧食與油脂,2010(8):40-42

[3] 姚佳,蒲彪.青花椒的研究進展[J].中國調(diào)味品,2010,6(35):35-39

[4]趙秀玲.花椒的化學成分、藥理作用及其資源開發(fā)的研究進展[J].中國調(diào)味品,2012,37(3):1-5

[5]杜麗君,鄭國華,牛先前.花椒屬植物的藥理研究進展與展望[J].熱帶作物學報,2013,34(5):995-999

[6] Yang G,Chen D.Alkaloids from the roots of Zanthoxylum nitidum and their antiviral and antifungal effects[J].Chemistry&Biodiversity,2008,5(9):1718-1722

[7] 李宏梁,薛婷.花椒果皮的研究進展[J].中國調(diào)味品,2014,39(1): 124-128

[8] 王英超.索氏提取法提取地膚子油[J].食品研究與開發(fā),2011,32 (12):26-29

[9]弭向輝,龔祝南,張衛(wèi)明.花椒揮發(fā)油的提取、分離和抗菌實驗[J].南京師大學報:自然科學版,2004,27(4):63-66

[10]唐裕芳,唐小輝,張妙玲.花椒揮發(fā)油化學組成及抑茵活性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(8):63-68

[11]周日寶,吳佳,童巧珍,等.不同提取方法中白術(shù)揮發(fā)油成分的比較研究[J].中藥材,2008,31(2):229-232

[12]盛萍,王颯,苗莉娟,等.不同方法提取的多傘阿魏揮發(fā)油化學成分及其體外抗胃癌活性比較[J].中成藥,2013,35(11):2442-2448

[13]董曉慶,曲桂娟,程培,等.白屈菜生物堿提取工藝研究[J].飼料工業(yè),2009,30(20):36-39

[14]陳乃東,周飛.亳芍生物堿提取及含量測定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2013,20(10):49-51

[15]涂瑤生,江志強,孫冬梅,等.黃連生物堿提取及純化工藝研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,23(2):208-212

[16]向莉,李盾.HPLC法研究黃連中表小檗堿等五種生物堿的含量[J].成都中醫(yī)藥大學學報,2004,27(1):46-48

[17]葉耀輝,賀瑾,應亞賓,等.貝母生物堿提取分離方法的研究進展[J].贛南醫(yī)學院學報,2013,33(4):629-634

[18]白明潔,黨保華,曹陽,等．赤擬谷盜生活史參數(shù)[J]．糧食儲藏, 1999,28(3):8-14

[19]浦冠勤,毛建萍,沈智蓉,等.繭絲害蟲赤擬谷盜的生物學特性及防治研究[J]．絲綢,2007,(5):24-25

[20]李建慶,梅增霞,張永安.白僵菌蛋白類代謝物對舞毒蛾毒性生測方法的研究[J].濱州學院學報,2007,23(3):42-46

[21]師超,涂錫茂,馮雪春,等.6種殺螨劑對朱砂葉螨不同生測方法的毒力比較[J].農(nóng)藥,2012,51(3):222-224

[22]張舒,常向前,呂亮,等.氯蟲苯甲酰胺和甲維鹽對甘藍小菜蛾三種不同生測方法的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2011,50(22):4601-4602,4605-4606

[23]HE Lin,GAO Xi-wu,WANG jin-jun,et al.Genetic Analysis of Abamectin Resistance in Thtrancychus cinnabarinus[J].Pesticide Biochemistry and physiology,2009,3(95):147-151

[24]金異開.芹菜乙醇提取液對果蠅趨避·觸殺·熏蒸效果[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(9):3763-3764

[25]汪玉平,鐘玉林,徐艷霞.土荊芥提取物對玉米象的觸殺與熏蒸活性[J].應用昆蟲學報,2011,48(6):1775-1778

[26]陸馳宇,史家浩,李紹勤.13種植物精油和茴香腦對赤擬谷盜成蟲熏蒸活性研究[J].中國糧油學報,2014,29(2):72-75

[27]張華鐘,虹敏,尚妍,等.中藥材硫磺熏蒸檢測方法[J].世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(4):685-688

[28]李強,吳莉宇,蒼濤.辣蓼揮發(fā)油對小菜蛾的熏蒸及忌避活性測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2006,34(21):5596-5598

[29]張志祥,徐漢虹,程東美.EXCEL在毒力回歸計算中的應用[J].昆蟲知識,2002,39(1):67-70

The Insecticidal Activity Study of Different Zanthoxylum Extraction

KOU Yun-yun，CHEN Xin*，WANG Xu，LIN Dong，SUN Wei-kuang，LIU Liang
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The contact action，stomach action，fumigation action and repellent action of different extraction to tribolium castaneum were studied by dropping，feeding，Triangle bottle airtight fumigation and Residual films. The result indicated that the contact action reached the highest level that LC50 was 1.086 463 g/mL and the repellent action reached a high level that was93.617%when Zanthoxylum were handled after n-butyl alcohol leached and extracted by petroleum ether.The result showed that the different Zanthoxylum extraction exhibited both insecticidal activity，and were worthy investigation.

Zanthoxylum；insecticidal activity；tribolium castaneum

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.001

2015-01-27

國家糧食公益性行業(yè)科研專項（201313002）

寇蕓蕓（1990—），女（漢），在讀碩士，研究方向：天然藥物活性物質(zhì)研究。

*通信作者：陳新（1978—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品功能成分研究與開發(fā)。