王軍,王忠合,章斌,伍振西
(韓山師范學(xué)院生物系,廣東潮州521041)
麥麩多糖理化特性與抗氧化性分析
王軍,王忠合*,章斌,伍振西
(韓山師范學(xué)院生物系,廣東潮州521041)
采用超聲波法提取麥麩粗多糖,研究其理化性質(zhì)、總糖含量、清除自由基能力及抗氧化性等特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,麥麩粗多糖含有淀粉和蛋白質(zhì)的多糖,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到42.48%,具有一定的清除羥自由基、超氧陰離子和亞硝酸根離子的能力,對(duì)雞蛋卵黃和小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化具有一定的抑制作用。
麥麩;多糖;抗氧化;清除自由基
多糖作為一類重要的生物活性物質(zhì),具有抗病毒、抗腫瘤、降血脂、提高免疫力等多種生物功能[1-3],不但能治療機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷的癌癥,還能治療多種免疫缺損疾病,如慢性病毒性肝炎和某些細(xì)菌和病毒引起的慢性疾病,還能治療風(fēng)濕病之類的自身疾病,有的多糖還能誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生,等等。國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)[4-7]對(duì)植物中多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行了大量的研究證明,從植物或微生物等提取的天然多糖,具有來源廣泛、毒副作用低、安全性高、免疫增強(qiáng)功能廣泛等優(yōu)點(diǎn),是一種理想的免疫增強(qiáng)劑。
麥麩是小麥加工的主要副產(chǎn)物,含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等,廣泛用于飼料工業(yè)、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域[8]。麥麩中的葡聚糖、木聚糖、纖維素、阿魏酸、植酸等生理活性物質(zhì),具有飽水性、穩(wěn)定性及抗腫瘤、抗氧化等功能活性,它能防治許多疾病,如抑制大腸癌的發(fā)生,預(yù)防糖尿病、高血壓等[9-10]。隨著人們健康意識(shí)的不斷提高,麥麩中的功能因子越來越受到人們的重視,因此,深入研究麥麩的開發(fā)與利用具有較高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法制備麥麩粗多糖,并深入分析其理化特性及抗氧化性,旨在為麥麩及其多糖的開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。
1.1 試劑與儀器
小麥麥麩 購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng),粉碎過40目篩,貯存于-20℃中備用;小白鼠昆明種,購(gòu)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院;木瓜蛋白酶 酶活力60~70萬(wàn)單位/g,廣州遠(yuǎn)天酶制劑廠;濃硫酸、苯酚、硫代巴比妥酸、硫酸亞鐵、三氯乙酸、正丁醇、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氯化鈉、雙氧水、葡聚糖、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。
UV-2800紫外可見分光光度計(jì):尤尼科(上海)儀器有限公司;Anke TFL-16G臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;KQ-100DV型數(shù)控超聲波清洗器:江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;AUW120型電子天平:SHIMADZU(日本)公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 麥麩粗多糖的制備
參照文獻(xiàn)[11]中的方法,韓山師范學(xué)院生物系食品加工實(shí)驗(yàn)室自制。
1.2.2 理化特性的研究
參照文獻(xiàn)[12]中的方法分別進(jìn)行溶解性、苯酚-硫酸反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、280 nm紫外吸收光譜。
1.2.3 總糖含量的測(cè)定
采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中總糖的含量,取50mg麥麩粗多糖溶于100mL水中,稀釋10倍,再取1mL置于10m L具塞試管中,加水補(bǔ)至2.0m L,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟[13]比色測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(如圖1所示):A=6.195C-0.006 4,(R2=0.995 5)求得樣品溶液中多糖濃度,計(jì)算多糖含量。
式中:C為總糖的濃度,(mg/mL);V為樣品溶液的體積,mL;K為稀釋倍數(shù);m為樣品重量,mg。
1.2.4 對(duì)超氧陰離子的清除作用
采用鄰苯三酚自氧化法[6-7]測(cè)定麥麩多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用,取9mLpH 8的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液與1mL麥麩多醣溶液混合,于25℃恒溫15min,取混合液于比色皿中加入45mmol/L的鄰苯三酚(用0.01mol/L鹽酸配置)0.1mL,搖勻,反應(yīng)3min,在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。以0.1mL蒸餾水代替鄰苯三酚所測(cè)得的吸光度為A2;以1.0mL蒸餾水代替樣品溶液所測(cè)得的吸光度為A3。按照下式計(jì)算對(duì)超氧陰離子的清除率P:
1.2.6 對(duì)卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制作用
采用依賴雞蛋卵黃的脂質(zhì)過氧化模型計(jì)算樣品抑制率[16],新鮮卵黃用0.1mol/L的PBS溶液(pH7.4)按1∶1配成懸液,再稀釋25倍,磁力攪拌30min。向試管中加入卵黃懸液0.5mL;然后依次加入濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的樣液1.0mL(對(duì)照管加入相同體積的PBS)、25mmol/L的硫酸亞鐵0.5mL,并用0.1mol/L的PBS補(bǔ)至4.0mL,置于37℃水浴中,振蕩50min。取出后加入20%三氯乙酸1m L,靜置10min后,以3 000 r/min離心15min,取上清液4 m L加入0.8%硫代巴比妥酸(TBA)2mL,塞緊管口,于沸水浴中反應(yīng)15min,最后在532 nm處測(cè)定樣品的吸光度值,取平均值并根據(jù)以下公式計(jì)算樣品抑制率。
式中:A0為對(duì)照液吸光度值;A1為樣品液吸光度值。
1.2.7 對(duì)小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用
小鼠禁食過夜后斷頭放血處死,迅速取出肝臟組織,置于冷生理鹽水中,沖洗后制成5%的組織勻漿[17],向每支試管中加入5%的組織勻漿1.5mL,再加入不同濃度的樣液0.2mL(對(duì)照組用生理鹽水代替),用生理鹽水補(bǔ)充至2.0mL,混勻后于(37±0.5)℃恒溫震蕩1.5h,加入20%三氯乙酸1.5mL終止反應(yīng)。3 500 r/min離心10min,取上清液2mL,加入0.67%硫代巴比妥酸(TBA)1.5mL,95℃水浴保溫處理15min,取出后冷卻,于532 nm處測(cè)定樣品的吸光度值,計(jì)算丙二醛(MDA)的生成抑制率。
1.2.8 對(duì)亞硝酸根的清除作用
分別向每支25mL具塞刻度試管中加入1.0mL亞硝酸鈉溶液(約5μg亞硝酸鈉),依次加入樣液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,搖勻,37℃保溫30min,再加入對(duì)
1.2.5 對(duì)羥自由基的清除效果
取三支試管,在試管中依次加入0.5mL 9.1mmol/L水楊酸—乙醇溶液,0.5 mL麥麩多糖溶液,0.5 mL 9mmol/L的Fe2+溶液,3.5mL蒸餾水,最后加入5mL 88mmol/L的H2O2啟動(dòng)Fenton反應(yīng),搖勻后于510 nm處測(cè)定吸光度A1;取0.5mL的蒸餾水代替9mmol/L的Fe2+溶液所測(cè)得的吸光度為A2;取0.5mL的蒸餾水代替酶解物所測(cè)得的吸光度為A3。按照下式[15]計(jì)算羥自由基清除率P:氨基苯磺酸溶液(4 g/L),混勻,靜置5 min后各加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液(2 g/L),加水至刻度,混勻,靜置15min,于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算亞硝酸根離子的含量N殘留。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)[18],求得空白組樣品中亞硝酸根離子的含量N空白,按照下式計(jì)算亞硝酸根離子的清除率:
1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD表示,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。
2.1 理化性質(zhì)
麥麩粗多糖呈現(xiàn)淺黃色,塊狀,無(wú)臭無(wú)味,無(wú)揮發(fā)性,易溶于熱水,不溶于高濃度乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。麥麩粗多糖化學(xué)特性鑒定結(jié)果如表1所示。
由表1可知,苯酚-硫酸呈陽(yáng)性表明有糖存在;碘-碘化鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性,表明有淀粉存在;三氯化鐵反應(yīng)呈陰性,表明不含酚類物質(zhì);斐林試劑反應(yīng)呈陽(yáng)性,表明有還原性糖存在;茚三酮反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)和紫外吸收光譜表明含有蛋白質(zhì);采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量為46.62%。
2.2 麥麩多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用
超氧陰離子是活性氧之一,可轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌淖杂苫撬醒踝杂苫那吧?,過量的超氧陰離子對(duì)生物體的危害較大[19]。麥麩多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用如圖2所示。
從圖2中可知,麥麩多糖清除超氧陰離子的能力隨著多糖濃度的增大而增高,根據(jù)圖中模擬方程可求得其清除超氧陰離子的IC50值為83.97mg/mL,這表明麥麩多糖對(duì)超氧陰離子有一定的清除效果。
2.3 麥麩多糖對(duì)羥自由基的清除作用
羥自由基是高反應(yīng)自由基,反應(yīng)距離短,速度快,攻擊力強(qiáng),幾乎能與細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)。它可介導(dǎo)脂質(zhì)氧化,蛋白質(zhì)解聚、聚合,核酸斷裂和多糖裂解等生化反應(yīng),引發(fā)組織細(xì)胞病變,導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老,是已知的最活潑的活性氧自由基[20]。減少此類自由基可預(yù)防衰老,心血管疾病,并具有防癌抗癌的作用。麥麩多糖對(duì)羥自由基的清除效果如圖3所示。
由圖3可知,在Fenton反應(yīng)體系中添加麥麩多糖可清除羥自由基,麥麩多糖對(duì)羥自由基的清除率隨濃度的增加而增強(qiáng),根據(jù)圖中模擬方程求得其IC50值為1.42mg/m L,這表明麥麩多糖具有較好的清除羥自由基的能力。
2.4 麥麩多糖對(duì)亞硝酸根的清除作用
亞硝酸鹽易引起食物中毒,食入0.3 g~0.5 g的亞硝酸鹽即可引起中毒甚至死亡。麥麩多糖對(duì)亞硝酸根的清除效果如圖4所示。
從圖4可知,麥麩多糖溶液對(duì)亞硝酸根離子具有清除作用,隨著樣液濃度的增大,清除效果逐漸增大,其IC50值為197.27mg/mL,其清除能力較小,低于不溶性膳食纖維的清除能力[21],這可能與麥麩多糖離子表面的電荷有關(guān)。
2.5 麥麩多糖抗脂質(zhì)過氧化的作用
脂質(zhì)過氧化物是生物膜和亞細(xì)胞膜中磷脂質(zhì)所含多元不飽和脂肪酸被自由基損傷、氧化形成的過氧化產(chǎn)物,可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA和RNA結(jié)構(gòu)破壞等生化毒性反應(yīng),造成機(jī)體衰老和多種疾病[22]。麥麩多糖對(duì)卵黃和小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制效果如圖5和圖6所示。
隨著麥麩多糖濃度的不斷增大,其對(duì)卵黃和小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用也逐漸增強(qiáng),其IC50值分別為7.80mg/mL和3.72mg/mL,麥麩粗多糖可有效地抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的丙二醛(MDA),從而呈現(xiàn)抗脂質(zhì)過氧化的能力。
高脂血癥和動(dòng)脈硬化的發(fā)生及形成與機(jī)體的脂質(zhì)過氧化所造成的損傷有關(guān),血脂濃度過高,能量代謝和氧氣的需求量水平提高,在呼吸鏈中產(chǎn)生超氧陰離子自由基的幾率增加,并通過脂質(zhì)過氧化等作用,使肝臟膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白發(fā)生氧化修飾和過氧化物MDA修飾,增生的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過攝取被氧化修飾的血脂而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞,從而加速脂質(zhì)條紋的形成[19,20,23]。麥麩多糖通過抑制過氧化脂質(zhì)的形成,調(diào)節(jié)肝臟的脂質(zhì)代謝,對(duì)小鼠的高血脂癥和動(dòng)脈硬化的形成和發(fā)展具有預(yù)防作用。
1)麥麩粗多糖易溶于熱水,不溶于高濃度乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑,含有淀粉、蛋白質(zhì)和還原性糖,不含酚類物質(zhì),總糖含量達(dá)46.62%。
2)麥麩多糖可清除超氧陰離子、羥自由基和亞硝酸根,其IC50值分別為83.97、1.42、197.27mg/mL。
3)麥麩多糖對(duì)卵黃和小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化作用具有明顯的抑制效果,其IC50值分別為7.80mg/mL和3.72mg/m L。
4)麥麩多糖具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力,可添加于食品中制備具有較強(qiáng)保健效果的功能性食品,也可用于延長(zhǎng)食品的貯藏期等方面。
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Study on the Physicochemical and Antioxidant Properties of Polysaccharides from Wheat Bran
WANG Jun,WANG Zhong-he*,ZHANG Bin,WU Zhen-xi
(Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,Guangdong,China)
In this paper,the polysaccharides were extracted from wheat bran by ultrasonic-assisted enzymatic technology,and physicochemical properties,total sugar content,free radical-scavenging ability and antioxidant properties were also investigated.Results showed that wheat bran polysaccharides contained some starch and protein,and the total sugar content reached 42.48%.Moreover,wheat bran polysaccharides could scavenge hydroxyl free radical,superoxide anion and nitrite ion,and had good antioxidant properties in lipid peroxidation models of egg yolk and mouse liver.
wheat bran;polysaccharide;antioxidant property;radical-scavenging ability
10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.005
2013-12-24
廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2013040015478);廣東省高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2013LYM0056);韓山師范學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目(QD20130516&QD20140324);韓山師范學(xué)院一般項(xiàng)目(LY201306);潮州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013X05&2013X06)
王軍(1981—),女(漢),講師,博士,研究方向:食品加工副產(chǎn)物的綜合利用。
*通信作者:王忠合(1980—),男,講師,博士,研究方向:食品加工與安全控制。