梁宏 黃靜 趙佳 陳哲 王長彪

（山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，太原　030031）

生物防治棉花黃萎病的研究進展

梁宏 黃靜 趙佳 陳哲 王長彪

（山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，太原030031）

隨著人們環(huán)境保護意識的增強，棉花黃萎病的生物防治成為目前研究的重要方向。評述了已取得的研究進展，包括生防菌類型、生防菌抗菌物質(zhì)與拮抗基因的研究進展及微生態(tài)有機肥防治棉花黃萎病的應用，并指出了棉花黃萎病生物防治的發(fā)展趨勢，為今后棉花黃萎病的生物防治提供借鑒。

棉花黃萎??；生物防治；生防菌；微生物群落

棉花黃萎?。╒erticillium wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的土傳病害，特點是發(fā)病范圍廣、流行性強、發(fā)病率高，是棉花生產(chǎn)過程中最具毀滅性的病害之一［1］。大麗輪枝菌是一種土傳和種傳的真菌，分類學上屬半知菌亞門、淡色孢科輪枝菌屬。關于棉花黃萎病菌的致病機理主要有機械障礙和毒素作用兩種觀點。由于一直沒有找到理想的防治技術與控制方法，此病被稱為棉花的“癌癥”，已成為制約我國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

1 棉花黃萎病的防治現(xiàn)狀

目前，國內(nèi)外對棉花黃萎病的防治主要是采用輪作倒茬、選育抗病品種、化學防治等傳統(tǒng)手段，但防病效果都不理想。黃萎病微菌核在土壤中存活時間久、寄主多、非寄主作物經(jīng)濟價值低，輪作并不減少土壤中微菌核數(shù)量；黃萎病菌致病力變異大，抗性品種不易獲得，或者獲得后容易喪失。此外，品種的抗性與豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)未達成有機的統(tǒng)一，一些抗性較強品種的產(chǎn)量和品質(zhì)不及常規(guī)品種，棉農(nóng)難以接受［2-6］?；瘜W農(nóng)藥雖然在一定程度上可以減輕黃萎病對棉花的危害，但是農(nóng)藥的使用帶來的環(huán)境問題也越來越受到社會的廣泛關注。

近年來，以生物防治為主的綜合防治措施日益受到人們重視，該方法具有環(huán)境友好、綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢，在棉花土傳黃萎病的防治中具有非常重要的意義［7-10］。目前，利用生物方法防治棉花土傳黃萎病主要集中在以下幾個方面。

2 利用無毒或弱毒菌系誘導棉花抗病

利用無毒菌系（NPs）或弱毒菌系（WPS）侵染棉株，誘導棉株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性或進行交叉保護，是生物防治棉花黃萎病的一種重要方法。Zhu等［11］分離到兩株棉花黃萎病弱毒株系CVd-WHw與CVn-WHg。將它們接種到已感染黃萎病強毒株系CVd-AYb的棉花植株上，試驗表明植株的病情指數(shù)下降，交叉保護效果明顯。

需要指出的是棉花對黃萎病的誘導抗性研究和利用尚處于初級階段。病原菌的弱毒株系存在轉變?yōu)閺娭虏∠档臐撛谖ｋU，或者弱毒株系本身就是其他某種作物的強致病系，因此選擇安全有效的誘導子非常重要［12］。

3 利用生防菌防治棉花黃萎病

防治棉花黃萎病，采用生防菌防治是重要途徑［13］。生防菌通過競爭作用、拮抗作用和誘導系統(tǒng)抗性等機制發(fā)揮生物防治效果，且常常是多種機制共同起作用［14］。對棉花黃萎病拮抗菌的篩選和防病基因工程菌的研究、開發(fā)，是目前棉花黃萎病生物防治研究的主要內(nèi)容。

3.1 棉花黃萎病生防菌種類

用于防治棉花黃萎病的生防微生物的種類很多，報道種類最多的是細菌、真菌和放線菌。

3.1.1 拮抗細菌 細菌以生長快、抗逆性強和次生代謝產(chǎn)物多而著稱，是生物防治棉花黃萎病的主要菌群。防治棉花黃萎病的拮抗細菌種類很多，如嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、厚壁菌、節(jié)桿菌、變形菌、歐文氏菌、假單胞菌和芽孢桿菌等［14］。近期研究應用較多的是芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（B. subtilis）與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。它們不僅能拮抗植物病原菌，而且生命力強，定殖率高，又具有一定的促生作用，因此備受各國研究者的青睞［15］。Tehrani等［16］從土壤中分離到5株高效拮抗大麗輪枝菌菌株，經(jīng)鑒定為2株假單胞桿菌、2株芽孢桿菌。制成菌劑應用于大田試驗，證明這5株菌株不僅對棉花黃萎病有拮抗作用，而且能不同程度地提高棉花的產(chǎn)量。李杜增［17］從棉花根際土壤中分離篩選得到一株枯草芽孢桿菌NCD-2可有效拮抗大麗輪枝菌，棉花產(chǎn)量和單鈴重、纖維品質(zhì)等質(zhì)量指標均有較大幅度的提高。陳英化等［18］從棉花健株莖內(nèi)分離篩選到一株解淀粉芽孢桿菌，對黃萎病菌具有強烈抑制作用，且定殖能力強。美國有4株枯草芽孢桿菌生防菌株（EB03、MB1600、QST713和FZB2）已獲得環(huán)保局（EPA）商品化或有限商品化生產(chǎn)應用許可。

最近，利用植物內(nèi)生細菌防治棉花黃萎病已成為熱門研究方向。植物內(nèi)生細菌廣泛定殖于棉株各個組織細胞內(nèi)或細胞間隙，并與棉株建立了穩(wěn)定的互利共生關系。內(nèi)生細菌具有可在棉株體內(nèi)定殖，受外界影響小，能抵御黃萎病菌的侵染，且能提高棉株抗黃萎病能力，刺激棉株生長等優(yōu)點。Li等［19］分離篩選39株內(nèi)生細菌防治落葉型棉花黃萎病，溫室和大田試驗顯示防病效果顯著。夏正俊等［20］從健康棉花植株莖內(nèi)篩選到73a、Ala等菌株，它們能夠高效拮抗大麗輪枝菌的內(nèi)生菌。其中73a菌株既能拮抗大麗輪枝菌又能阻礙其分泌毒素，室內(nèi)防治率70%以上，大田試驗亦取得了良好的防治效果。同時，還發(fā)現(xiàn)在拮抗菌可誘導臨近組織細胞內(nèi)的過氧化物酶（Peroxidase，POD），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性提高，且這些同工酶活性與植株抗病性正相關［7］。

3.1.2 拮抗真菌 防治棉花黃萎病的拮抗真菌種類很多，其中研究較多的是木霉（Trichodermo spp.）和黃色蠕形霉（Talaromyces flavus）［21］。木霉在自然界中生長快，分布廣，易分離。李雪玲等［22］從發(fā)生過黃萎病病害的棉田中篩選得到3株拮抗大麗輪枝菌的木霉菌株。大田試驗說明，對棉花黃萎病的防治率達到38.2%-53.5%。宋曉研等［23］篩選到一株對大麗輪枝菌有很強抑制力的木霉菌株SMF。它可分泌幾丁質(zhì)酶等多種細胞壁降解酶類和耐熱抑菌物質(zhì)。兩者共同作用于大麗輪枝菌，拮抗效果強烈。孟娜等［24］分離篩選得到4株木霉菌種。它們對大麗輪枝菌的生長具有抑制作用，能有效地抑制菌絲的伸長。Fahima等［25］通過電鏡觀察了黃色蠕形霉寄生棉花黃萎病菌內(nèi)的作用。他發(fā)現(xiàn)了黃色蠕形霉菌絲可以侵入到大麗輪枝菌的微菌核中。其分泌的代謝產(chǎn)物，在離體條件和土壤中能夠殺傷大麗輪枝菌的微菌核，并且，抑制菌絲生長。劉潤進等［26］用菌根真菌處理棉花后，棉花體內(nèi)菇類物質(zhì)和同工酶含量增加，幾丁質(zhì)酶活性增強。可有效防治棉花黃萎病。

3.1.3 拮抗放線菌 鏈霉菌（Streptomyces spp.）是放線菌中防治棉花黃萎病的代表性菌種。放線菌分泌多種抗菌素，可有效抑制大麗輪枝菌的生長。Xue等［27］分離篩選到4株拮抗黃萎病菌的鏈霉菌菌株，它們能分泌真菌細胞壁降解酶類，包括幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡萄糖苷酶、纖維素酶和蛋白酶等，使大麗輪枝菌生長受阻甚至死亡。該4株菌的定殖能力強，防治率達到18.7%-65.8%。劉大群等［28］從27株鏈霉菌菌株中篩選出了3株高效拮抗大麗輪枝菌菌株，其分泌物可使黃萎病菌菌絲膨大破裂。王蘭英等［29］從土壤中分離篩選到28株放線菌。通過抑菌圈試驗篩選出拮抗作用強的4株菌，其發(fā)酵原液對大麗輪枝菌的拮抗作用顯著強于發(fā)酵濾液和菌絲提取液。研究表明，放線菌分泌的多種抗菌素可有效抑制棉花黃萎病菌的生長。

3.2 生防菌的定殖效率

在大田環(huán)境中生防菌對棉花黃萎病的防治效果很大程度上取決于生防菌能否在棉株根際穩(wěn)定繁殖，并在根際微生物群落中占據(jù)優(yōu)勢地位。植物根際土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)最為豐富，尤其是植物根尖的細胞連接處、側根萌發(fā)點等部位分泌物較多、水分濕度大，是包括病原菌在內(nèi)的多種微生物定殖的理想場所。在這些位置的占位能力是決定生防菌能否定殖的關鍵，進而決定其能否有效拮抗病原菌的生長繁殖。根際菌群數(shù)量是生防菌定殖后防治效率高低的首要因素。如果生防菌在根際土壤中不能成功地定殖，其他所有的抑菌機制都沒有真正的生防價值［30］。

一些生防菌定殖能力較強，并且能在土壤微生物群落中占據(jù)優(yōu)勢地位，生態(tài)位占位能力強。它們能分泌對大麗輪枝菌有拮抗作用的代謝產(chǎn)物。土質(zhì)、土壤溫度、土壤容重和鹽堿度等土壤因素影響生防菌在棉花根際的定殖效果，其中，土壤溫度是生防菌定殖的決定性因素。研究生防菌的定殖規(guī)律可以闡明棉花根際微生物區(qū)系結構特征，還可以對生防菌在棉花根際的適應性和生防效果進行評價，同時，可以進一步揭示生防菌的抑病機理。

3.3 生防菌抗菌物質(zhì)研究與應用

生防菌在棉株根際定殖后能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其中一些代謝產(chǎn)物可對大麗輪枝菌的細胞壁、能量與物質(zhì)代謝體系、生物膜的通透性等產(chǎn)生影響，使大麗輪枝菌生長受阻甚至死亡。這些拮抗物質(zhì)包括小分子量的抗生素和細胞壁降解酶等。

3.3.1 抗生素 抗生素類物質(zhì)作用于大麗輪枝菌，能降解細胞壁、抑制生物合成與能量代謝系統(tǒng)，或者通過提高棉花的抗病力來防治棉花黃萎病?？股赜泻颂求w和非核糖體合成兩大類，核糖體合成的小分子量抗菌多肽-細菌素；非核糖體合成的抗生素包括脂肽抗生素（Lipopeptin）、多糖類抗生素（Aps）和其他有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物。目前，芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽抗生素是新的熱點研究領域，報道較多的有表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturins）和芬枯草菌素（Fengycin）3大類［31，32］。

表面活性素分為3種類型：SurfactinA、B和C。其具有親水性頭部與親脂性尾部的特異結構，具有使中間纖維合成受阻，嵌入磷脂雙分子層使質(zhì)膜通透性增大，CAMP合成受阻等多種生理功能。伊枯草菌素拮抗真菌能力強而拮抗細菌能力較弱。伊枯草菌素的拮抗機理為：使磷脂雙分子層的導電率增大，導致質(zhì)膜的成孔率提高，通透性增大。芬枯草菌素由前體物質(zhì)fenA、B、C、D和E合成相關基因簇。其拮抗絲狀霉菌能力強大，在抑菌圈范圍內(nèi)的菌絲受芬枯草菌素影響泡囊顏色轉黃，尖端變形膨大使泡囊破裂，造成內(nèi)容物外泄，抑制菌絲生長［14］。

3.3.2 細胞壁降解酶類 棉花黃萎病由真菌引起，幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖是合成真菌細胞壁的主要成分。某些生防菌能夠合成并分泌幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，使病源真菌的細胞壁降解細胞死亡，起到拮抗黃萎病菌的作用［14］。β-1，3-葡聚糖酶降解黃萎病菌菌絲體細胞壁使得細胞膨大細胞壁壓力降低，導致菌絲體頂端細胞破裂，內(nèi)容物外泄，細胞死亡。當葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶共同作用時，拮抗作用更為強烈。

3.4 棉花黃萎病拮抗基因的研究進展

目前，將外源基因?qū)朊藁w內(nèi)是獲得抗黃萎病植株的有效手段之一。棉花黃萎病抗病基因工程中應用的基因主要有幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、植物防衛(wèi)素、硫素及葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GO）等外源抗病基因。其中，比較成功的報道是GO 基因。該基因編碼的葡萄糖氧化酶催化 β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2，H2O2可直接抑制病原菌的生長，同時也可作為信號轉導物質(zhì)誘導棉株系統(tǒng)抗性的形成［33］。張寶紅等［34］將 GO 基因?qū)朊藁?，獲得了對黃萎病抗性明顯提高的棉花株系。但是GO基因在棉株內(nèi)的表達可引起植株產(chǎn)生植物毒素并使棉花產(chǎn)量下降，且H2O2不是特異性抑制病原菌的生長，還會抑制其他有益菌生長。目前用于轉化的基因大部分是具有廣譜抗性的抗真菌基因，而對黃萎病病菌專抗的基因很少，從拮抗菌培養(yǎng)液中純化出抗棉花黃萎病致病菌蛋白，通過測得蛋白序列克隆出抗病基因是可行的方案，要想提高轉基因棉的黃萎病抗性還需加大科研力度。

4 微生態(tài)有機肥防治棉花黃萎病

4.1 微生態(tài)有機肥防治棉花黃萎病機理

根際微生物群落是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它們與植物病害特別是土傳病害密切相關。棉花根際微生物群落變化與黃萎病害關系的研究已經(jīng)成為棉花病理學研究較為活躍的領域。根際微生態(tài)區(qū)系調(diào)控是指將土壤微環(huán)境、植物、根際微生物區(qū)系結構作為一個有機整體進行研究，通過調(diào)整根際微生物的區(qū)系結構，使得病原微生物在微生物群落中居于從屬地位，將其生物量及危害程度置于可控范圍內(nèi)，從而達到防病治病的目的［35］。根際微生物區(qū)系調(diào)控是防治棉花黃萎病的新思路，是微生物學與植物病理學結合的具體實踐。微生態(tài)有機肥料的功能微生物菌群包括黃萎病生防菌群和促生功能菌群，其與有機肥混和二次發(fā)酵形成特殊復合有機肥料。這些肥料投入棉花病田，使棉株根際土壤中肥力充足，為功能微生物菌群提供了良好的生存環(huán)境，使這些功能微生物在土壤中大量繁殖，并處于優(yōu)勢地位，充分發(fā)揮其拮抗大麗輪枝菌、促進棉株生長、提高根系吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)能力等作用。向棉花病田土壤施加微生態(tài)有機肥可以顯著提高染病植株根際土壤微生物種群的多樣性。當根際微生態(tài)區(qū)系結構越合理，物種越豐富，多樣性越高時，植株對抗黃萎病菌的綜合能力就越強［35］。近年來，掃描電鏡技術、分子生物學技術等新技術為開展根際微生態(tài)系統(tǒng)調(diào)控研究提供了有效的手段。

此外，微生物有機肥料有機質(zhì)含量豐富，是一種全營養(yǎng)肥料。施入棉田后可以增加土壤有機質(zhì)含量，增進土壤碳循環(huán)與礦質(zhì)利用。土質(zhì)改善可促進棉株生長，提高棉株的抗病力［36］。

4.2 微生態(tài)有機肥的施用效果

微生態(tài)有機肥防治棉花黃萎病有顯著的防病效應，南京農(nóng)業(yè)大學沈其榮教授課題組的研究取得較好成果。張慧［37］將分離到的3種棉花黃萎病生防菌（Bacillus vallismortis和Bacillus subtilis）、促生功能菌與有機肥混和發(fā)酵，盆栽試驗防病效果達到57%，且棉苗的植株高、鮮重、干重都有明顯增加；羅佳［38］利用育苗缽育苗并在移栽大田時穴施微生態(tài)有機肥進行防治，黃萎病防治率80%；連續(xù)3年盆栽試驗，黃萎病發(fā)病率為零。實踐表明，將功能微生物菌群與有機肥復合的微生態(tài)有機肥能夠顯著降低連作棉花根際土壤中的大麗輪枝菌的數(shù)量，防治棉花黃萎病效果明顯，應用推廣潛力巨大。

5 展望

科研人員針對棉花黃萎病生物防治做了大量的研究工作，但這方面的研究仍然存在一些問題，其中最主要的問題是生物防治效果不夠穩(wěn)定。基于微生態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)技術，利用微生態(tài)有機肥防治棉花黃萎病效果顯著，展現(xiàn)出良好的應用推廣潛力?，F(xiàn)代生物技術的發(fā)展為黃萎病的生物防治提供了新的契機，應將遺傳學、栽培學、分子生物學和生態(tài)學方法結合使用，明確防病機理，提高防治效果，使得以生物防治為主的棉花黃萎病綜合防治技術能夠切實有效的推廣，為我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮更重要的作用。

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［38］ 羅佳. 微生物有機肥防治棉花黃萎病的作用機制［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學， 2010.

（責任編輯 狄艷紅）

Studies on Biocontrol of Cotton Verticillium Wilt

Liang Hong Huang Jing Zhao Jia Chen Zhe Wang Changbiao
（Biotechnology Research Center，Shanxi Provincial Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan030031）

With the enhanced awareness of environmental protection， biocontrol of Cotton Verticillium wilt is proved to be an important field. This paper reviews the research progress have been achieved， including the type of biocontrol bacterium；the research progress on antibacterial substances and antagonistic genes；the application on bio-organic fertilizer. Points out the trends of biocontrol Verticillium wilt and provides a reference for future research.

Verticillium wilt；biocontrol；biocontrol bacteria；microbial community

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.001

2014-08-29

國家轉基因生物新品種培育重大專項（2009ZX08003-017B），山西省農(nóng)業(yè)科學院科技攻關項目（2013GG22）

梁宏，男，助理研究員，研究方向：微生物學；E-mail：lh1964@126.com

王長彪，男，碩士，助理研究員，研究方向：分子生物學；E-mail：wcbksl@126.com