郭永博 蔡原

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州　 730070）

西藏藏豬遺傳多樣性研究

郭永博 蔡原

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

采用mtDNA D-loop作為分子標(biāo)記，對(duì)西藏的4個(gè)藏豬群體（林芝、山南、昌都和日喀則）遺傳多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，西藏藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)A+T含量（62.90%）明顯高于 G+C 含量（37.1%），富含A和T，存在堿基偏倚性。在長(zhǎng)度為435 bp的序列中，共檢測(cè)到20個(gè)變異位點(diǎn)，界定了26個(gè)單倍型，單倍型多樣度（Hd）為0.705±0.021，平均核苷酸差異數(shù)（k）為1.231，核苷酸多樣度（Pi）為0.002 83。其中，Hd、k和Pi在昌都藏豬群體中最高，日喀則藏豬最低。此外，Hap1和Hap3單倍型是4個(gè)群體的共享單倍型，表明4個(gè)藏豬群體存在兩個(gè)共同的母系祖先單倍型。

藏豬；mtDNA D-loop；單倍型；遺傳多樣性

藏豬是世界上少有的高原型豬種，是唯一能夠適應(yīng)高原海拔氣候和以放牧為主的豬種［1］。藏豬主產(chǎn)于青藏高原，包括云南迪慶藏豬、四川阿壩及甘孜藏豬、甘肅的合作豬以及分布于西藏自治區(qū)山南、林芝、昌都等地的藏豬類群。由于近年來繁殖育種手段不斷改進(jìn)，高強(qiáng)度選育，加之生態(tài)環(huán)境的改變，致使許多擁有豐富遺傳資源的地方品種數(shù)量銳減，純種藏豬的分布范圍和數(shù)量正在不斷減少，已面臨種群滅絕的危險(xiǎn)［2］。因此，最大限度地保存藏豬的遺傳多樣性是藏豬保護(hù)與利用面臨的突出問題。

mtDNA D-loop，即mtDNA的非編碼區(qū)，該區(qū)的進(jìn)化速率較其他區(qū)域高5-10倍，是目前mtDNA研究的熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物遺傳多樣性和種內(nèi)、種間親緣關(guān)系等方面的研究［3-5］，甘佳等［6］以微衛(wèi)星標(biāo)記測(cè)定了四川境內(nèi)阿壩、稻城和德格3個(gè)藏豬遺傳多樣性。近年來，應(yīng)用mtDNA研究豬的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育比較多［7-9］，Gou等［10］評(píng)估了隨機(jī)和選擇性繁殖豬種群之間的遺傳多樣性，結(jié)果表明隨機(jī)繁育種群?jiǎn)伪缎投鄻有燥@著大于選擇性繁育種群；Li等［11］研究了西藏野豬的遺傳適應(yīng)與高海拔有關(guān)，表征了家豬唾液分泌增加的遺傳基礎(chǔ)；Jiao等［12］測(cè)定藏豬的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，合作豬目前具有較高的遺傳多樣性，可以進(jìn)行合理利用；Zhao等［13］利用mtDNA研究了中國(guó)豬的起源和演化，表明了中國(guó)國(guó)內(nèi)豬可能是起源于野生長(zhǎng)江中游地區(qū)及中國(guó)南方的公豬；Gou等［14］通過研究藏豬、亞洲家豬和野豬mtDNA高變區(qū)，認(rèn)為在西藏高原和東南亞島嶼地區(qū)存在家豬的兩個(gè)新的起源中心；張亞平等［15］測(cè)定了云南4 個(gè)地方豬品種的mtDNA D-loop高變區(qū)，結(jié)果顯示mtDNA 多態(tài)能有效作為品種內(nèi)遺傳多樣性指標(biāo)，及云南4個(gè)地方豬品種大多數(shù)個(gè)體起源于一個(gè)野豬亞種［15］。以mtDNA分子標(biāo)記研究西藏藏豬遺傳多樣性報(bào)道較少，因此，本研究對(duì)分布在西藏4個(gè)藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)序列進(jìn)行研究，以期為藏豬資源保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采集了西藏林芝藏豬、山南藏豬和昌都藏豬3個(gè)群體共267頭藏豬血液樣品，詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法 參照 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［16］，采用常規(guī)酚-氯抽提法提取基因組DNA。根據(jù)發(fā)表在GenBank中的西藏藏豬mtDNA D-loop序列（Accession：AF486868）設(shè)計(jì)引物：上游引物（PL16405）：5'-ATACCAATCACTAGCATCAT-3'；下游引物（P-H653）：3'-CCGGATCATGAGTTCCATGAAGT-5'。

進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系體積 為：60 μL， 其 中：10×Buffer 5.0 μL（Mg2+1.5 mmol/L）、dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL、上下游引物各5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、模板DNA 1 μL，加雙蒸水至28.0 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min；94℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司純化并進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 測(cè)得的原始序列，通過Chromas-Version2.33（http：//www.technelysium. com.au/chromas. html）進(jìn)行人工編輯，校對(duì)電泳峰圖與堿基對(duì)應(yīng)關(guān)系，剪切非研究區(qū)域序列。分析中引用來自于GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）的西藏藏豬相關(guān)序列，見表1。并用 MEGA 5.0（http：//www.megasoftware.net）建立序列數(shù)據(jù)庫(kù)，采用 Clustal X 1.8（http：//www.igbmc.ustrasbg.fr/pub/ ClustalX）進(jìn)行同源序列比對(duì)分析。采用 DnaSP 5.10.1（http：//www.ub.edu/dnasp）進(jìn)行核苷酸變異位點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性分析以及計(jì)算單倍型多樣度、核苷酸多樣度和平均核苷酸差異度。

表1 樣品信息

2 結(jié)果

2.1 mtDNA D-loop高變區(qū)SNPs分析

西藏藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)經(jīng)擴(kuò)增、 測(cè)序、編輯后，獲得長(zhǎng)度為435 bp核苷酸序列。用MAGE5.0軟件進(jìn)行堿基分析發(fā)現(xiàn)，T、C、A和G 4種核苷酸的平均比例分別為27%、24%、35.90%和13.10%，A+T 含量（62.90%）明顯高于 G+C 含量（37.1%），可見藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)富含A和T，同時(shí)體現(xiàn)了哺乳動(dòng)物線粒體DNA堿基組成的基本特點(diǎn)。利用Dnasp5.10.1軟件對(duì)4個(gè)藏豬446個(gè)個(gè)體的 mtDNA D-loop 區(qū)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析（single nucleotide polymorphism，SNP），共檢測(cè)到20個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，占所測(cè)核苷酸的4.60%，說明該核苷酸序列突變率小，有較好的穩(wěn)定性，其中有3個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)和17個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（表2）。

表2 西藏藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)變異位點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)

堿基變異數(shù)（S）分布結(jié)果（圖1-A）表明，在第1-40個(gè)堿基之間沒有發(fā)現(xiàn)堿基變異，說明這是一個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域，變異區(qū)在第41個(gè)堿基與435個(gè)堿基之間，而高變區(qū)集中在第 157-417 堿基之間。核苷酸多樣度（Pi：序列間每個(gè)位點(diǎn)的平均核苷酸差異數(shù)）變化趨勢(shì)（圖 1-B）顯示，D-loop區(qū)核苷酸多樣度最高峰值出現(xiàn)在第250堿基左右（圖1）。

圖 1 mtDNA D-loop高變區(qū)序列堿基變異（A）及核苷酸多樣度（B）分布

2.2 遺傳多樣性分析

核苷酸多樣性分析表明，西藏藏豬單倍型多樣度（Hd±Sd）、核苷酸多樣度（Pi）和平均核苷酸差異數(shù)（k）分別為0.705±0.021、0.002 83和1.231。其中，山南藏豬和昌都藏豬兩個(gè)群體的3個(gè)多樣性參數(shù)均高于西藏藏豬的整體水平，而林芝藏豬和日喀則藏豬群體均低于整體水平（表3）。無論從單倍型數(shù)、單倍型多樣度還是核苷酸多樣度來看，昌都藏豬遺傳多樣性最高，而日喀則藏豬最低。

表3 西藏藏豬mtDNA D-loop遺傳多樣性

2.3 單倍型分析

西藏藏豬單倍型分析表明，根據(jù)檢測(cè)到的20個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，界定了26個(gè)單倍型（Hap1-Hap26，表4）。其中，兩個(gè)及以上群體的共享單倍型共有13個(gè)，而4個(gè)群體共享的只有2個(gè)（Hap1和Hap3）。群體間的特有單倍型數(shù)差異較大，除日喀則藏豬沒有特有單倍型，其他3個(gè)群體都存在特有單倍型，其中林芝藏豬特有單倍型數(shù)最多（6個(gè)），占單倍型總數(shù)的23.08%，山南藏豬特有單倍型最少（3個(gè)）。單倍型頻率差異較大，Hap1單倍型頻率最高，有229個(gè)個(gè)體，Hap6、Hap3、Hap9和Hap16頻率依次降低，個(gè)體數(shù)分別為51、42、32和29。其余11個(gè)單倍型頻率都低于10。

表4 西藏藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)變異位點(diǎn)分布

3 討論

3.1 藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)序列特征

由于飼養(yǎng)量下降和雜交改良等因素，藏豬資源受到嚴(yán)重威脅［17］，現(xiàn)已被列入《 國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》。開展藏豬種質(zhì)資源調(diào)查研究，可為其遺傳資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過西藏藏豬mtDNA D-loop序列遺傳多樣性來揭示遺傳資源的保護(hù)必要性。在分析的446頭西藏藏豬mtDNA D-loop長(zhǎng)度為435 bp的核苷酸序列中，不考慮插入、缺失和 Poly（C）末端長(zhǎng)度變異的條件下，共檢測(cè)到20個(gè)變異位點(diǎn)，占核苷酸總數(shù)的4.60%，表明西藏藏豬具有較低的遺傳變異，其中，昌都藏豬堿基變異位點(diǎn)數(shù)最多（16個(gè)），日喀則最少（2個(gè)），說明昌都藏豬受選育程度和人工選擇機(jī)率較其他3個(gè)群體高，而日喀則藏豬可能由于地域差異、長(zhǎng)期近交使得基因群體內(nèi)具有較高的遺傳一致性，這與蔡原等［7］研究一致。mtDNA分子是由很不均一的片段構(gòu)成的，G+C含量在21%-50%，其中無脊椎動(dòng)物為21%-43%，脊椎動(dòng)物為37%-50%［18］，本試驗(yàn)中為37.10%，略高于變化范圍最低值。堿基組成分析表明，A+T平均含量62.90%，顯著高于G+C含量37.10%。其中，A+T的含量可以反映出序列的變異性，具有高比例的A+T可能是 D-loop 序列變異較快的原因之一，同時(shí)也說明mtDNA D-loop高變區(qū)富含A、T，表現(xiàn)出很強(qiáng)的堿基偏倚性，這一結(jié)果與mtDNA D-loop 序列進(jìn)行家禽［19，20］、羊［21，22］、牛［23，24］和豬［25，26］等家養(yǎng)動(dòng)物的研究結(jié)果一致。

3.2 西藏藏豬遺傳多樣性分布規(guī)律

單倍型多樣度（Hd）和核苷酸多樣度（Pi）是衡量一個(gè)mtDNA 變異程度的兩個(gè)重要指標(biāo)，Hd值和Pi值越大，多樣性程度越高，遺傳多樣性越豐富，反之，多樣性程度越低，遺傳多樣性越貧乏。另外，mtDNA的單倍型多樣性指數(shù)也可以衡量種內(nèi)的變異程度，它的含義類似于核DNA的雜合度［27］。據(jù)統(tǒng)計(jì)同種動(dòng)物的個(gè)體之間的平均核苷酸順序奇異值在0.3%-4.0%，有時(shí)甚至可高達(dá)10%［28］。本研究的西藏藏豬4個(gè)，總的單倍型數(shù)20個(gè)，單倍型多樣度（Hd±Sd）為0.705±0.021，平均核苷酸差異數(shù)（k）為1.231，核苷酸多樣度（Pi）為 0.002 83。研究結(jié)果顯示，昌都藏豬、山南藏豬單倍型多樣度、平均核苷酸差異數(shù)、核苷酸多樣度均高于整體水平，而林芝藏豬低于整體水平，日喀則藏豬明顯低于整體水平，并且依次降低，證明昌都和山南藏豬品種的遺傳變異程度較高，遺傳基礎(chǔ)比較廣泛，具有豐富的遺傳多樣性［29］，可能由于昌都藏豬的群體數(shù)量較大且分布范圍較廣，而日喀則藏豬則局限在一個(gè)較為封閉的環(huán)境中，與其它群體之間基因交流的機(jī)會(huì)極少［30］?；趍tDNA D-loop序列對(duì)梅山豬、二花臉、蘇鐘豬和保山豬遺傳多樣性分析表明，其Hd和Pi值分別為0.784、0.400、0.838、0.883和0.005 6、0.000 9、0.004 7、0.003 9，表明二花臉的多樣性低于其他3個(gè)豬種［31］。采用相同的研究方法研究表明合作、迪慶、甘孜、阿壩4個(gè)藏豬群體Hd分別為0.963、0.930、0.303和0.830，Pi分別為0.008 2、0.005 5、0.000 7和0.003 6［12］。本研究中，藏豬Hd和Pi分別為0.705和0.002 83，與梅山豬、二花臉、蘇鐘豬和保山豬及藏豬合作群體、迪慶群體和阿壩群體相比，其遺傳多樣性僅高于二花臉豬和藏豬中的甘孜群體，說明了西藏藏豬群體受人工選擇的影響小，長(zhǎng)期自然條件產(chǎn)生的突變類型在該群體中得到積累，但可能由于與外界交流少，群體內(nèi)近親高度繁殖，使其遺傳多樣性比較有限［32］。同時(shí)，瓶頸效應(yīng)與人工選擇共同導(dǎo)致了西藏藏豬等在內(nèi)的中國(guó)家豬遺傳多樣性的降低，特別是高強(qiáng)度選擇豬種對(duì)地方豬種的雜交產(chǎn)生的后果更為嚴(yán)重。對(duì)26個(gè)單倍型進(jìn)行區(qū)域分布研究發(fā)現(xiàn)，昌都藏豬單倍型多樣度最高，也高于西藏藏豬的整體水平，同時(shí)相對(duì)于其它3個(gè)群體，單倍型數(shù)最多，也說明昌都藏豬的遺傳多樣性最豐富。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織歷年關(guān)于家養(yǎng)動(dòng)物報(bào)告中都涉及到有關(guān)遺傳多樣性調(diào)查的內(nèi)容，不斷改進(jìn)和完善保存理論和保存機(jī)制，不斷加大各區(qū)域保種項(xiàng)目的投資力度［33］，因此，在藏豬遺傳資源保護(hù)過程中應(yīng)該遵循遺傳多樣性原則進(jìn)行優(yōu)先保護(hù)。

3.3 西藏藏豬系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

Hap1和Hap3是4個(gè)群體的共享單倍型，說明可能具有共同的兩個(gè)母系起源。有研究表明，包括藏豬在內(nèi)的家豬來源于歐洲野豬和亞洲野豬［34-36］，而且是多次馴化事件的結(jié)果［37］，就不同藏豬群體而言存在著共同的母系起源，但在幾千年的馴化中形成了不同的進(jìn)化分枝，由于生活環(huán)境差異各群體也存在一定數(shù)量的特有單倍型，且頻率差異較大［25］，其中藏豬的進(jìn)化分支有一定的地理特征，即群體特異性，歐洲起源家豬與亞洲起源家豬及藏豬明顯的分為兩個(gè)不同的進(jìn)化枝，在藏豬群體中西藏藏豬與甘孜豬處于同一個(gè)進(jìn)化枝，而合作豬形成了一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分枝，阿壩豬在各個(gè)進(jìn)化枝中都有出現(xiàn)［12］，而西藏藏豬中除日喀則藏豬沒有特有單倍型，其它3個(gè)都存在特有單倍型，其中林芝藏豬特有單倍型數(shù)最多（6個(gè)），占單倍型總數(shù)的23.08%，山南藏豬特有單倍型最少（3個(gè)）?？赡苡捎谌湛t藏豬沒有經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇，受人工選育的程度低，致使該群體沒有形成各自獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)，其余3個(gè)群體雖然在遺傳結(jié)構(gòu)上有獨(dú)特性，但它們都屬于一個(gè)地區(qū)，與日喀則藏豬群體有密切的關(guān)系［38，39］。

4 結(jié)論

本研究對(duì)西藏藏豬mtDNA D-loop高變區(qū)特征、遺傳多樣性分布規(guī)律和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究表明，昌都藏豬的遺傳多樣性最高，山南藏豬、林芝藏豬、日喀則藏豬遺傳多樣性依次降低，說明昌都藏豬的群體數(shù)量較大且分布的范圍較廣，而日喀則藏豬則局限在一個(gè)較為封閉的環(huán)境中，群體間相距較遠(yuǎn)，基因交流的機(jī)會(huì)較少，外界交流較少，群體內(nèi)高度近交繁殖，受人工選育程度低，但它們可能具有共同兩個(gè)母系起源，在遺傳資源保護(hù)過程中應(yīng)遵循遺傳多樣性原則進(jìn)行優(yōu)先保護(hù)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Study of Genetic Diversity in Tibetan Pig of Tibet

Guo Yongbo Cai Yuan
（Faculty of Animal Science & Technology，Gansu Agriculture University，Lanzhou730070）

mtDNA D-loop was selected as a marker to determine genetic diversity of the 4 Tibetan pig populations（Nyingchi， Shannan，Chamdo and Shigatse）in Tibet. The results showed A + T content（62.90%）was significantly higher than the G + C content（37.1%），indicating that Tibetan pigs’ mtDNA D-loop was rich in A and T； there was the presence of a base bias. A total of 20 variable sites and 26 haplotypes were identified in the 435 bp nucleotide sequence of mtDNA D-loop， haplotype diversity（Hd）was 0.705 ± 0.021， the average number of nucleotide differences（k）was 1.231， and nucleotide diversity（Pi）was 0.00283. Among them， Hd， k and Pi were the highest in Chamdo Tibetan pig population， and lowest in Shigatse. In addition， Hap1 and Hap3 were 4 shared haplotypes， revealing that there were 2 common maternal ancestor haplotypes in 4 Tibetan pig populations.

Tibetan pig；mtDNA D-loop；haplotype；genetic diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.034

2014-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（青年）項(xiàng)目（31101682）

郭永博，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳理論與應(yīng)用；E-mail：guoyongbo016@163.com

蔡原，女，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖；E-mail：caiyuan@gsau.edu.cn