周文臣詹曉北，朱莉鄭志永吳劍榮

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院　糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫　214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，無(wú)錫　214125）

農(nóng)藥多抗性哈茨木霉的常壓室溫等離子體誘變

周文臣1詹曉北1，2朱莉2鄭志永1吳劍榮1

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，無(wú)錫214125）

旨在為提高生防木霉菌對(duì)田間除草劑、殺蟲(chóng)劑以及殺菌劑共存的復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)性，以生防菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum，GIM 3.442）為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體的方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變。結(jié)果顯示，以殺菌劑代森錳鋅和殺蟲(chóng)劑呋蟲(chóng)胺為篩子，選育出對(duì)復(fù)合農(nóng)藥有良好抗性的誘變菌株。從中挑選雙抗性最好的菌株Th-36，以含有殺菌劑代森錳鋅、殺蟲(chóng)劑呋蟲(chóng)胺和除草劑乙氧氟草醚的PDA為誘變篩選培養(yǎng)基，再次進(jìn)行誘變篩選，獲得兩株具有三抗特性菌株（Th-3-36和Th-4-B）。毒力測(cè)試表明，抗性菌株Th-3-36和Th-4-B對(duì)代森錳鋅、呋蟲(chóng)胺和乙氧氟草醚的EC50分別達(dá)到5 089.2 μg a.i.·mL-1和5 498.2 μg a.i.·mL-1、758.5 μg a.i.·mL-1和785.9 μg a.i.·mL-1、198.2 μg a.i.·mL-1和200.3 μg a.i.·mL-1，均高于各農(nóng)藥的市售平均推薦使用濃度。篩選到的突變株對(duì)農(nóng)藥抗性明顯增強(qiáng)、遺傳了親本的廣譜抗菌性并具有良好的遺傳穩(wěn)定性，生長(zhǎng)繁殖能力和酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)于親本菌株。

常壓室溫等離子體誘變（ARTP）；哈茨木霉；農(nóng)藥抗性；馴化選育

傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥由于操作簡(jiǎn)單、見(jiàn)效迅速、能快速大規(guī)模生產(chǎn)而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，但其泛濫使用會(huì)導(dǎo)致“3R”（抗性Resistance、殘留Residue、再猖獗Resurgence）問(wèn)題和生態(tài)環(huán)境惡化［1，2］。生物防治（biological control）是利用天然產(chǎn)物，生物體如細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)或其代謝產(chǎn)物等對(duì)植物病害進(jìn)行有效防治的技術(shù)與方法［3］，而生防制劑（biological control agents，BCAs），即生物殺菌劑是利用天然產(chǎn)物、微生物活體及其代謝產(chǎn)物所生產(chǎn)的、對(duì)植物病害起防治作用的制劑。它不僅可以減少傳統(tǒng)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的危害、在動(dòng)植物體中的殘留，還可以避免病菌對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性而導(dǎo)致的農(nóng)藥失效［4］。典型的生防菌，如木霉菌（Thchoderma spp.），由于其生存范圍廣泛、拮抗病原菌廣譜（至少對(duì)18個(gè)屬，29種病原真菌具有拮抗性）［5，6］，對(duì)溫度、pH、氧濃度和紫外照射等不利環(huán)境條件耐受性強(qiáng)［7］，防病機(jī)制多樣，低毒且對(duì)環(huán)境友好，已經(jīng)應(yīng)用于許多大田作物和園藝作物的土傳真菌病害的防治［8］。目前全球已經(jīng)約有50多種木霉制劑在售［9］。根據(jù)最新報(bào)道，許多生防木霉菌還能起到改善土壤環(huán)境［10］，降解殘留農(nóng)藥的作用［11］。

哈茨木霉是目前使用最多的生防木霉菌，可以用于防治如絲核菌、疫霉菌、腐霉菌等植物病原真菌［12］。早在1981年，哈茨木霉防治李屬果栩銀葉?。–hondrostereum purpureum）的木霉生防制劑已經(jīng)在西歐商品化生產(chǎn)［13］，近年來(lái)，以色列、美國(guó)拜耳公司也推出哈茨木霉生防制劑產(chǎn)品［14］。但是，在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，植物病原菌、雜草、蟲(chóng)害等有害生物共存于農(nóng)田生態(tài)環(huán)境之中，某些殺蟲(chóng)劑、除草劑以及其他化學(xué)殺菌劑的使用和殘留會(huì)對(duì)生防木霉的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量產(chǎn)生不良的影響，也導(dǎo)致木霉生防作用下降，限制了其田間單獨(dú)使用的效果和范圍。因此，生防木霉菌與農(nóng)藥的關(guān)系［15］，通過(guò)誘變育種、原生質(zhì)體融合、遺傳改造等手段改良野生生防菌的特性［16-18］、提高其耐藥性和與其他殺菌劑的混用［19-22］，已經(jīng)引起人們的興趣與重視。但是，目前的研究多集中在生防菌對(duì)殺菌劑的抗性提高，有關(guān)木霉菌對(duì)除草劑和殺蟲(chóng)劑的抗性提高的報(bào)道很少，還未有對(duì)除草劑和殺蟲(chóng)劑抗性菌株的選育的報(bào)道。由清華大學(xué)開(kāi)發(fā)的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（ARTP）能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25-40℃之間、具有高活性粒子（包括處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流，改變細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁通透性、DNA和蛋白質(zhì)等大分子結(jié)構(gòu)，造成基因損傷從而引起微生物發(fā)生突變［23］。近年來(lái)，該項(xiàng)突變技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用于突變細(xì)菌、微藻、酵母等微生物［24-26］。生防木霉菌對(duì)農(nóng)藥的敏感性與細(xì)胞骨架的重要組成成分微管有關(guān)，微管的主要成分為微管蛋白，微管蛋白和農(nóng)藥的親和力下降，造成真菌耐藥［27］。ARTP對(duì)蛋白質(zhì)等大分子的結(jié)構(gòu)影響以及前人應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)突變微生物的成功案例使得ARTP在改造生防菌耐藥性能方面潛力巨大，但目前為止還未見(jiàn)到有應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)改良生防木霉菌性能的報(bào)道。本研究以哈茨木霉（Trichoderma harzianum GIM 3.44）為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體誘變（ARTP）和含復(fù)合農(nóng)藥培養(yǎng)基相結(jié)合的方法篩選對(duì)農(nóng)藥有交叉抗性的生防木霉菌，挑選出兩株對(duì)殺蟲(chóng)劑呋蟲(chóng)胺、除草劑乙氧氟草醚和殺菌劑代森錳鋅具有綜合抗性的抗藥性菌株，并檢測(cè)其各項(xiàng)生理指標(biāo)，旨在為提高生防木霉菌對(duì)田間除草劑、殺蟲(chóng)劑及殺菌劑共存的復(fù)雜環(huán)境適應(yīng)性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）GIM 3.442，購(gòu)于中國(guó)廣東省微生物菌種保藏中心。棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. Sp）ACCC 36882、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）ACCC 36211、核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）ACCC 36908，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani），由江南大學(xué)生化工程與生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)室活化并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 保藏和孢子制備：馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（PDA）（g/L）：馬鈴薯汁200，葡萄糖20，KH2PO43，MgSO4·7H2O 1.5，硫胺素0.008，瓊脂20，pH6.0，于121℃滅菌20 min。

含藥PDA培養(yǎng)基的制備：先把農(nóng)藥用無(wú)菌水配制成母液，再用滅菌水稀釋成一定倍數(shù)，添加到40-50℃的綜合PDA培養(yǎng)基中。

液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，酵母浸粉 15，（NH4）2SO42.5，KH2PO46.0，MgSO4·7H2O 0.8，pH6.0，25℃。

1.1.3 試劑 除草劑：果兒（乙氧氟草醚23.5%乳油），上?；莨庥邢薰荆讳z當(dāng)家（30%草甘膦水型），深圳諾普信農(nóng)化有限公司；蓋能草（高效氟吡甲禾靈，108 g/L乳油），美國(guó)陶氏益農(nóng)。

殺菌劑：75%百菌清可濕性粉劑，利民化工股份有限公司；80%代森錳鋅可濕性粉劑，印度聯(lián)合磷化有限公司；99%噁霉靈可濕性粉劑，山東天達(dá)股份有限公司。

殺蟲(chóng)劑：20%呋蟲(chóng)胺可濕性粉劑，日本三井化學(xué)AGRO株式會(huì)社；快絕特（0.3%苦參堿水型），南通新華農(nóng)藥有限公司。

N-乙酰-氨基葡萄糖和海帶多糖購(gòu)于Sigma公司，其余試劑均為國(guó)藥生產(chǎn)。

1.1.4 誘變系統(tǒng) ARTP（常壓室溫等離子體）誘變育種儀，江南大學(xué)生物工程學(xué)院購(gòu)于清華大學(xué)無(wú)錫應(yīng)用技術(shù)研究院生物育種研究中心，產(chǎn)品型號(hào)：ARTP-Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 ARTP誘變哈茨木霉 將保存在斜面的哈茨木霉菌株經(jīng)過(guò)液體培養(yǎng)基25℃，110 r/min震蕩培養(yǎng)活化后涂布到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5-7 d至孢子成熟。用30 mL左右的無(wú)菌生理鹽水沖洗孢子，沖洗液經(jīng)滅菌紗布（4層）過(guò)濾除去菌絲體，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成OD500的值在0.54-0.88（孢子濃度在108cfu/mL）之間的孢子懸浮液。誘變方法參照邱雯雯等［24］的誘變處理，稍加改動(dòng)，分別取20 μL孢子懸浮液至7個(gè)載片涂抹均勻，載片置于滅菌平板內(nèi)，分別經(jīng)ARTP誘變系統(tǒng)（室溫常壓，氦氣流量為10 SLM，功率為100 W）處理0、30、60、100、140、180和220 s。處理后的載片經(jīng)滅菌生理鹽水沖洗稀釋至合適倍數(shù)后涂布到含有代森錳鋅16 μg a.i.·mL-1，呋蟲(chóng)胺4.5 μg a.i.·mL-1的復(fù)合誘變培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5-6 d后菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，選取致死率95%以上的誘變劑量為處理劑量。在選定誘變劑量下，將處理后的孢子懸浮液分別稀釋的合適倍數(shù)后涂布到含有兩種目標(biāo)農(nóng)藥的梯度復(fù)合含藥培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5-6 d后將形成的菌落邊緣用8 mm打孔器切取菌餅轉(zhuǎn)接到復(fù)合含藥PDA上，25℃恒溫培養(yǎng)，生長(zhǎng)勢(shì)法挑選生長(zhǎng)較快的菌株，轉(zhuǎn)接到PDA斜面上保存待分析。挑選雙抗菌株后，按照雙抗菌株的篩選方法篩選對(duì)3種農(nóng)藥（呋蟲(chóng)胺、代森錳鋅、乙氧氟草醚）抗性均提高顯著的目標(biāo)菌株。

1.2.2 農(nóng)藥對(duì)突變株室內(nèi)毒力的測(cè)定 采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法［28］，梯度稀釋。

用無(wú)菌打孔器從培養(yǎng)3 d的哈茨木霉突變株和原始菌株菌落邊緣截取直徑8 mm的菌塊，將其移植到含不同濃度的代森錳鋅（300、1 000、2 000、3 000和5 000 μg a.i.·mL-1）、呋蟲(chóng)胺（165、500、1 000、1 650和1 900 μg a.i.·mL-1）、乙氧氟草醚（60、120、240、480和700 μg a.i.·mL-1）的PDA平板中央，每個(gè)培養(yǎng)皿接1個(gè)菌餅，每個(gè)濃度3次重復(fù)，設(shè)空白平板為對(duì)照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

農(nóng)藥對(duì)突變株菌絲生長(zhǎng)速率的室內(nèi)毒力測(cè)定：供試菌株在上述條件下培養(yǎng)2 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。并按式（1）計(jì)算其生長(zhǎng)抑制率。

式中：I為抑制率，R0為對(duì)照菌落直徑，R為處理菌落直徑。

將各抑制率換算成抑制率概率值，以各處理中農(nóng)藥濃度對(duì)數(shù)值作為自變量x值，以相應(yīng)處理對(duì)菌絲的抑制率概率值為依變量y值，用線性回歸法求出供試殺菌劑的毒力曲線方程y=a+bx，計(jì)算EC50（抑制中濃度）。

農(nóng)藥對(duì)突變株產(chǎn)孢子能力的室內(nèi)毒力測(cè)定：供試菌株在上述條件下培養(yǎng)6 d，用30 mL無(wú)菌生理鹽水沖洗，玻璃珠打散，光電比濁法測(cè)定各農(nóng)藥梯度下的產(chǎn)孢子能力，按照測(cè)定農(nóng)藥對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)EC50的方法測(cè)定各農(nóng)藥對(duì)菌株產(chǎn)孢子能力的EC50。

農(nóng)藥對(duì)突變株孢子萌發(fā)的室內(nèi)毒力測(cè)定［29］：將供試菌株和親本菌株將在PDA生長(zhǎng)5-6 d用30 mL滅菌生理鹽水沖洗打散，經(jīng)滅菌紗布過(guò)濾除去菌絲體，稀釋到合適倍數(shù)吸取200 μL，以6×106cfu/mL的接種量接種到含有1.3 mL的含有梯度農(nóng)藥的液體PDA的24 孔培養(yǎng)板中?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀測(cè)定初始OD500，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)12 h后酶標(biāo)儀測(cè)定OD500，用空白PDA作對(duì)照，按照公式（2）計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率，并按照上述方法計(jì)算各農(nóng)藥對(duì)供試菌株的EC50。

式中：I為孢子萌發(fā)抑制率，OD1為對(duì)照0 h的OD500，OD2為處理0 h的OD500，OD0為對(duì)照12 h的OD500，ODC為處理12 h的OD500。

1.2.3 突變株生長(zhǎng)繁殖能力

1.2.3.1 菌絲平均生長(zhǎng)速率 將抗性突變體菌株和親本菌株在 25℃下培養(yǎng) 3-4 d，用直徑8 mm的打孔器沿菌落邊緣截取菌塊接種于PDA培養(yǎng)基上，在25℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，每6 d測(cè)定菌落直徑。選取12 h的直徑D1和36 h的直徑D2，按照式（3）計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速率，每處理3次重復(fù)。

式中：v為菌絲平均生長(zhǎng)速率（mm/h），D1為12 h菌落直徑，D2為36 h菌落直徑。

1.2.3.2 產(chǎn)孢子能力 采用光電比濁法。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將在PDA生長(zhǎng)5-6 d的哈茨木霉用30 mL滅菌生理鹽水沖洗打散，經(jīng)滅菌紗布過(guò)濾除去菌絲體，稀釋10、20、30、40、50和60倍，血球計(jì)數(shù)板準(zhǔn)確計(jì)數(shù)孢子個(gè)數(shù)，用分光光度計(jì)測(cè)定各個(gè)梯度的OD500值。以O(shè)D500為橫坐標(biāo)，孢子濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

哈茨木霉和突變株在PDA平板上生長(zhǎng)6 d后，按上述方法，測(cè)定產(chǎn)孢子能力。

1.2.3.4 分生孢子萌發(fā)率 將各突變株和原始菌株培養(yǎng)5-6 d后用30 mL液體PDA沖洗打散，稀釋到107cfu/mL，各吸取50 μL，滴加于凹玻片上，25℃保濕培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間顯微鏡下鏡檢，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.3.5 種子生長(zhǎng)曲線測(cè)定 刮取PDA培養(yǎng)基上的孢子接入到裝有無(wú)菌水的150 mL三角瓶（帶無(wú)菌玻璃珠）中，25℃，搖床振蕩培養(yǎng)2 h，使其混合均勻。

吸取5 mL孢子懸浮液接種到裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)（接種量10%），25℃，往復(fù)式搖床110 r/min培養(yǎng)。每隔6 h取5 mL發(fā)酵液，8 000 r/min，離心10 min，倒掉上清液取沉淀，水洗滌2-3次，105℃烘箱烘干至恒重。以搖床培養(yǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)、菌體干重（g/L）為縱坐標(biāo)繪制種子生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 突變株酶學(xué)性質(zhì) 反應(yīng)體系總體積600 μL包括：200 μL底物，200 μL pH6.0、0.025 mol/L磷酸鈉緩沖液，200 μL粗酶液（pH6.0，50℃），恒溫水浴反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴10 min終止反應(yīng)。

幾丁質(zhì)酶酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘水解生成1 μg N-乙酰-氨基葡萄糖為一個(gè)酶活力單位U。

β-1，3葡聚糖酶酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘水解生成1 μg葡萄糖為一個(gè)酶活力單位U。

1.2.5 突變株拮抗性 采用對(duì)峙培養(yǎng)法，將親本木霉菌株和耐藥性木霉菌株分別與核盤(pán)菌、馬鈴薯早疫病菌、棉花枯萎病菌和棉花黃萎病菌，對(duì)峙接種在PDA平板上，兩接菌點(diǎn)相距30 mm，菌塊直徑8 mm。同時(shí)單獨(dú)接種作對(duì)照。每處理重復(fù)3次，在25℃恒溫培養(yǎng)。逐日觀察各菌落的生長(zhǎng)和木霉菌對(duì)灰霉菌的抑制作用情況，連續(xù)觀察6 d，記錄R1和R2數(shù)據(jù)并拍照計(jì)算木霉菌平板覆蓋率。按照式（4）計(jì)算各木霉菌株對(duì)病原菌的抑制率。

式中：I為木霉的抑制率，R1為對(duì)照病菌落直徑，R2為病菌菌落中心到木霉菌落邊緣的距離。

木霉覆蓋植物病原菌的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：I：木霉菌絲占據(jù)培養(yǎng)皿100%；Ⅱ：木霉菌絲占據(jù)培養(yǎng)皿＞2/3；Ⅲ：木霉菌絲占據(jù)培養(yǎng)皿1/3-2/3；IV：木霉菌絲占據(jù)培養(yǎng)皿＜1/3；V：病原菌菌絲占據(jù)培養(yǎng)皿100%。

1.2.6 突變株遺傳穩(wěn)定性 突變型木霉菌株接種在PDA平板上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每5 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接10次。觀察這些菌株每次轉(zhuǎn)接后的生長(zhǎng)特性，測(cè)定突變株對(duì)抗性農(nóng)藥的EC50，每處理重復(fù)3次。將其與親本相比較。

1.2.7 突變株對(duì)其他農(nóng)藥的抗性 配制分別含有300 μg a.i.·mL-1的快絕特、百菌清、蓋能草和草甘膦配的含藥PDA，切取培養(yǎng)2-3 d的供試菌株8 mm菌塊轉(zhuǎn)接到含藥PDA中，25℃恒溫培養(yǎng)2 d，按照（1）式計(jì)算各農(nóng)藥對(duì)各突變株的菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS Statistics軟件和Duncan’s新復(fù)極差法比較Th和各突變株以及各突變株之間在各指標(biāo)上的顯著性差異（P=0.05）。用Image Optimizer軟件分析木霉菌拮抗各病原真菌的平板覆蓋率，用EXCEL計(jì)算毒力回歸方程和EC［30］。

50

2 結(jié)果

2.1 哈茨木霉的ARTP誘變及復(fù)合農(nóng)藥抗性菌株篩選通過(guò)ARTP誘變和藥劑反復(fù)馴化，選取致死率在95%以上的100 s為誘變劑量，以T. harzianum為出發(fā)株，以農(nóng)藥對(duì)菌株的菌絲生長(zhǎng)EC50為目標(biāo)，從200株疑似株中挑選得到5株雙抗菌株（Th-17、Th-36、Th-37、Th-41和Th-60，對(duì)代森錳鋅和呋蟲(chóng)胺有抗性），結(jié)果如圖1所示。其中，Th-36號(hào)菌株的代森錳鋅和呋蟲(chóng)胺EC50分別比出發(fā)菌株提高6.95倍和4.40倍。以雙抗菌株Th-36為誘變突發(fā)株，選取致死率為90%以上的90 s為處理劑量，在梯度綜合含藥平板上篩選，從180株疑似菌株中挑選得到兩株三抗（Th-3-36和Th-4-B，對(duì)代森錳鋅、呋蟲(chóng)胺和乙氧氟草醚有綜合抗性）菌株，結(jié)果如圖2所示。代森錳鋅對(duì)三抗菌株Th-3-36和Th-4-B的菌絲生長(zhǎng)EC50相比Th-36略有提高，分別達(dá)到5 089.2 μg a.i.·mL-1和5 498.2 μg a.i.·mL-1，是市售平均推薦使用濃度的5倍左右。相比Th-36，呋蟲(chóng)胺對(duì)兩株三抗突變株的菌絲生長(zhǎng)EC50的變化不大。經(jīng)過(guò)誘變后，突變株對(duì)乙氧氟草醚抗性明顯提高，乙氧氟草醚對(duì)Th-3-36和Th-4-B菌絲生長(zhǎng)EC50分別達(dá)到198.2 μg a.i.·mL-1和200.3 μg a.i.·mL-1，達(dá)到市售使用濃度（表1）。

圖1 雙抗性菌株篩選結(jié)果

2.2 抗藥性菌株遺傳穩(wěn)定性

將傳代前和傳代后菌株進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果如表1、表2所示。相比親本菌株，殺菌劑代森錳鋅、除草劑乙氧氟草醚和殺蟲(chóng)劑呋蟲(chóng)胺對(duì)突變株的菌絲生長(zhǎng)EC50、孢子產(chǎn)量EC50和孢子萌發(fā) EC50都比出發(fā)菌株有顯著提高，并且沒(méi)有隨傳代次數(shù)發(fā)生太大的改變，性狀遺傳穩(wěn)定。

圖2 供試菌株的菌絲生長(zhǎng)對(duì)抗性藥物的敏感性

2.3 突變株和出發(fā)菌株生長(zhǎng)特性比較

將突變株和親本菌株在PDA平板上培養(yǎng)，比較其菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力，結(jié)果如表3所示?？剐酝蛔冎甑木z生長(zhǎng)速率相對(duì)Th略有提高，變化較小。Th-3-36、Th-4-B和Th-36產(chǎn)孢子能力分別比出發(fā)菌株提高45%、39%和33%左右。在液體PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 h后，三抗性突變株的萌發(fā)率高于出發(fā)菌株，均在20%左右，Th為15%，但在培養(yǎng)12 h和24 h后突變株和出發(fā)株無(wú)顯著性差異。

表1 突變株的菌絲抑制EC50遺傳穩(wěn)定性

表2 突變株和出發(fā)菌株產(chǎn)孢子量和孢子萌發(fā)EC50

表3 突變株和親本菌株Th生長(zhǎng)特性比較

對(duì)比突變株和親本菌株的種子液生長(zhǎng)曲線（圖3），突變株進(jìn)入穩(wěn)定期相對(duì)親本菌株明顯縮短（突變株為24 h，Th為48 h），保持穩(wěn)定期的時(shí)間明顯延長(zhǎng)（突變株為36 h以上，Th為24 h）。此外，突變株最大生物量也高于出發(fā)菌株，三抗菌株可以達(dá)到16 g/L，雙抗菌株可以達(dá)到15 g/L以上，而親本菌株只有不到12 g/L。突變株更為旺盛的生命力可能與其更強(qiáng)的抗藥性之間存在某種關(guān)系。

圖3 突變株和Th生長(zhǎng)曲線比較

2.4 突變株和Th的酶學(xué)性質(zhì)比較

幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶能夠降解病原真菌的細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)和β-1，3葡聚糖，在生防菌拮抗病原真菌中作用重大。對(duì)突變株和出發(fā)菌株進(jìn)行上述兩種酶產(chǎn)酶能力測(cè)定，結(jié)果如表4所示。突變株和Th均在培養(yǎng)60 h后開(kāi)始產(chǎn)酶，但抗性突變株的β-1，3葡聚糖酶最大酶活力比親本菌株有所提高，Th-3-36是親本菌株的1.87倍左右，Th-4-B和Th-36菌株是Th的1.71倍左右。抗性突變株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力和發(fā)酵液總蛋白含量相對(duì)出發(fā)株稍有提高，但相差較小。

表4 突變株和親本菌株（Th）發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶總結(jié)

2.5 非抗性農(nóng)藥對(duì)突變株和Th的菌絲生長(zhǎng)抑制率比較

通常農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中會(huì)使用各種不同的農(nóng)藥，因此選擇了其他5種農(nóng)作物種植中常用農(nóng)藥，測(cè)試突變株對(duì)其耐受性。在劑量為300 μg a.i.·mL-1條件下測(cè)定菌絲生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果如表5所示。其中，突變株對(duì)噁霉靈的敏感性降低最大：三抗菌株Th-3-36和Th-4-B分別比親本菌株降低74.76%和96.35%左右，雙抗菌株比親本菌株降低88.93%左右，而且噁霉靈對(duì)Th-4-B的菌絲生長(zhǎng)抑制率僅為1.03%。突變株對(duì)草甘膦、蓋能草的敏感性比親本菌株降低程度沒(méi)有噁霉靈顯著，平均只比親本菌株降低19%（Th-36除外）和30%左右。兩株三抗突變株對(duì)草甘膦、百菌清和快絕特的敏感性和親本菌株差異較小，且這3種農(nóng)藥對(duì)木霉菌株抑制作用較大，300 μg a.i.·mL-1的濃度對(duì)木霉的抑制率就可以達(dá)到80%以上。

表5 非抗性農(nóng)藥對(duì)突變株和親本菌株（Th）的菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）

2.6 突變株的拮抗作用為了進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得的多抗性木霉菌株的生防抗菌能力，將病菌和木霉菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)。對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中，木霉菌株和植物病菌先分居平板兩側(cè)各自生長(zhǎng)，2 d左右，棉花黃萎病菌基本停止生長(zhǎng)，并在與木霉菌的接觸處出現(xiàn)抑菌帶，之后菌落逐漸萎縮消亡。棉花枯萎病菌、核盤(pán)菌和土豆早疫病菌在對(duì)峙培養(yǎng)3 d左右后，菌落停止生長(zhǎng)，之后逐漸萎縮。木霉菌迅速占領(lǐng)生長(zhǎng)空間，對(duì)病原真菌起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。對(duì)峙培養(yǎng)6 d后，平板上生長(zhǎng)空間大部分被綠色木霉菌覆蓋，以Th-4-B突變株和棉花枯萎病菌的對(duì)峙效果為例，如圖4-A所示。4種病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率結(jié)果（圖4-B）顯示，原始菌株和突變株對(duì)土豆早疫病菌和棉花黃萎病菌的抑制率達(dá)到90%以上，抗病等級(jí)為I級(jí)；對(duì)棉花枯萎病菌和核盤(pán)菌的抑制率達(dá)到70%以上，抗病等級(jí)為Ⅱ。突變菌穩(wěn)定遺傳原始菌株對(duì)植物病菌的拮抗性并對(duì)植物病原菌表現(xiàn)出良好的拮抗能力。

圖4 木霉菌對(duì)植物病菌的拮抗能力

3 討論

木霉菌作為生防因子作用于植物病蟲(chóng)害，相比化學(xué)農(nóng)藥具有顯著的優(yōu)勢(shì)，并已經(jīng)被許多學(xué)者在中藥［31］、小麥［32］等田間防治病害試驗(yàn)中證明。但在國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)作物栽培中，殺蟲(chóng)劑、殺菌劑和除草劑等化學(xué)農(nóng)藥的常年大量使用使得木霉菌在實(shí)際使用和商業(yè)化中受到限制。不同種類的殺菌劑對(duì)不同的生防木霉具有不同的抑制作用，從19世紀(jì)末20年代初起，常用農(nóng)藥對(duì)木霉的抑制作用已經(jīng)引起學(xué)者的興趣［33］；殺蟲(chóng)劑和土壤處理除草劑對(duì)生防木霉也有不同程度的影響，但近幾年才有少數(shù)相關(guān)報(bào)道［34］，并且并未見(jiàn)到采用誘變措施提高木霉對(duì)除草劑、殺蟲(chóng)劑的耐藥性，降低其敏感性的報(bào)道。

與前人誘變篩選提高木霉耐藥性相比，本研究首次嘗試采用常壓室溫等離子體誘變的方法提高木霉耐除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑的綜合能力。以含有殺蟲(chóng)劑（呋蟲(chóng)胺）、殺菌劑（代森錳鋅）和除草劑（乙氧氟草醚）的復(fù)合含藥培養(yǎng)基為篩子，成功篩選出對(duì)上述3種農(nóng)藥有高度耐受性的突變型木霉菌株Th-3-36和Th-4-B。殺菌劑和木霉生防菌聯(lián)用可以降低殺菌劑的使用濃度，并提高木霉菌的防效。牛勝芳等［19］發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺和哈茨木霉聯(lián)用可以防治番茄灰霉病菌且協(xié)同效果良好；Nallathambi等［35］將木霉菌T.v-CIAH240和多種殺菌劑聯(lián)用以防治果腐病，可降低化學(xué)農(nóng)藥的使用濃度，其中代森錳鋅的使用濃度降低到100 μg/g。本實(shí)驗(yàn)中代森錳鋅對(duì)突變株Th-3-36和Th-4-B的菌絲生長(zhǎng)EC50分別達(dá)到5 089.2 μg a.i.·mL-1和5 498.2 μg a.i.·mL-1，是市售平均推薦使用濃度的5倍左右，是尹婷等［16］誘變得到的耐藥性木霉T2對(duì)代森錳鋅的耐受性的20倍以上（EC50值為221 μg a.i.·mL-1），為突變木霉菌和代森錳鋅聯(lián)用奠定了基礎(chǔ)；呋蟲(chóng)胺對(duì)兩株突變株的菌絲生長(zhǎng)EC50分別達(dá)到758.5 μg a.i.·mL-1和785.9 μg a.i.·mL-1，是市售推薦使用濃度的4倍以上；乙氧氟草醚對(duì)兩株突變株的菌絲生長(zhǎng)EC50分別達(dá)到198.2 μg a.i.·mL-1和200.3 μg a.i.·mL-1，達(dá)到市售推薦使用濃度。篩選結(jié)果表明，通過(guò)ARTP和藥劑馴化培養(yǎng)的手段可以顯著提高木霉菌對(duì)農(nóng)藥的抗性，在使用誘變木霉菌作為生防農(nóng)藥的農(nóng)田，可以相應(yīng)使用呋蟲(chóng)胺和乙氧氟草醚除蟲(chóng)除草。

對(duì)其他農(nóng)藥的耐藥性測(cè)定表明，300 μg a.i.·mL-1的使用濃度下，噁霉靈對(duì)突變株的抑制率很小，木霉菌可以和噁霉靈混用防治植物病原真菌；在除草劑蓋能草和草甘膦存在的環(huán)境中，木霉菌可以生長(zhǎng)但生長(zhǎng)速度受到明顯的影響，生物拮抗能力可能被削弱；殺菌劑百菌清和殺蟲(chóng)劑快絕特對(duì)木霉菌株強(qiáng)烈抑制。對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明突變株穩(wěn)定遺傳親本對(duì)植物病原菌的生物拮抗性，能使病菌菌絲停止生長(zhǎng)，菌落消亡，培養(yǎng)6 d后木霉菌落覆蓋的抗病等級(jí)均在Ⅰ、Ⅱ級(jí)。突變株較出發(fā)菌株對(duì)棉花黃萎病菌和馬鈴薯早疫病菌的差別不大，對(duì)峙培養(yǎng)6 d后木霉長(zhǎng)滿病菌菌落，但對(duì)核盤(pán)菌和棉花枯萎病菌的抑制率提高，同時(shí)突變株的生長(zhǎng)繁殖能力和產(chǎn)β-1，3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的能力均高于出發(fā)菌株。生長(zhǎng)速率快可以更快地占領(lǐng)生長(zhǎng)空間、木霉產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶可以降解病菌的細(xì)胞壁從而導(dǎo)致病原真菌不能正常生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果很好地說(shuō)明了突變株拮抗能力提高的原因與其更高的生長(zhǎng)速率和更強(qiáng)的產(chǎn)胞壁降解酶能力有關(guān)。突變株更優(yōu)的抗藥性和菌種特性使其比T. harzianum更能適應(yīng)田間復(fù)雜的環(huán)境，具有良好的應(yīng)用前景。但本試驗(yàn)的研究只處于初試階段，并未對(duì)突變株活體植物拮抗能力以及菌藥協(xié)同對(duì)植物抗病能力作用的影響進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

本研究采用常壓室溫等離子體誘變的方法，以含有殺蟲(chóng)劑（呋蟲(chóng)胺）、殺菌劑（代森錳鋅）和除草劑（乙氧氟草醚）的復(fù)合含藥培養(yǎng)基為篩子，成功篩選出上述3種農(nóng)藥有高度耐受性的突變型木霉菌株Th-3-36和Th-4-B，其對(duì)代森錳鋅、呋蟲(chóng)胺和乙氧氟草醚的EC50分別達(dá)到5 000 μg a.i.·mL-1以上、750 μg a.i.·mL-1以上和190 μg a.i.·mL-1以上?？顾幮跃甑纳L(zhǎng)繁殖能力與β-1，3葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)能力均優(yōu)于出發(fā)菌株；對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)表明突變株穩(wěn)定遺傳親本對(duì)植物病原菌的生物拮抗性，能使病菌菌絲停止生長(zhǎng)，菌落消亡，菌落覆蓋抗病等級(jí)均在I、Ⅱ級(jí)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Mutagenesis of Trichoderma harzianum with Pesticide Mutipleresistance by Atmospheric and Room Temperature Plasma

Zhou Wenchen1Zhan Xiaobei1，2Zhu Li2Zheng Zhiyong1Wu Jianrong1
（1. Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122；2. Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd. Wuxi214125）

This study aimed to improve the adaptability of biocontrol Trichoderma in the complicated agricultural environment in where herbicides， insecticides， and fungicides co-exist. Trichoderma harzianum was used as initial strain and induced by atmospheric and room temperature plasma（ARTP）. The Trichoderma harzianum mutants resistant to both fungicides mancozeb and insecticide dinotefuran were obtained and one with the most double-resistance was named as Th-36. The mutant was subject to further mutation by ARTP and screened on the medium with mancozeb， dinotefuran and herbicide oxyfluorfen. Two mutants with triple-resistance were obtained and named as Th-3-36 and Th-4-B. The toxicity resistance test showed that EC50s of mancozeb for Th-3-36 and Th-4-B were up to 5089.2 μg a.i.·mL-1and 5498.2 μg a.i.·mL-1；for dinotefuran up to 758.5 μg a.i.·mL-1and 785.9 μg a.i.·mL-1；for oxyfluorfen up to 198.2 μg a.i.·mL-1and 200.3 μg a.i.·mL-1respectively. The above values were all higher than the average commercially recommended doses of these pesticides. The screened mutants showed the significant increasing resistance to pesticide， inherited parental broad-spectrum antibacterial property， and presented genetic stability. Furthermore growth capacity and enzyme characteristics of the mutants were better than those of the parental strains.

atmospheric and room temperature plasma（ARTP）； Trichoderma harzianum； pesticide resistance； domestication.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.033

2014-10-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171640，31271888），無(wú)錫市科技項(xiàng)目（CLE01N1208），無(wú)錫中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CBE01G1344）

周文臣，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；E-mail：717244030@qq.com

詹曉北，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生化工程與反應(yīng)器等研究；E-mail：xbzhan@yahoo.com