周亞娜，向 楠，陳 輝

(1．湖北省中醫(yī)院，武漢 430061;2．湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065)

補(bǔ)腎化痰法影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實驗研究*

周亞娜1，向 楠2△，陳 輝2

(1．湖北省中醫(yī)院，武漢 430061;2．湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065)

目的:研究補(bǔ)腎化痰法對BMSCs成骨分化的影響，探討補(bǔ)腎化痰法治療骨質(zhì)疏松癥的可能作用機(jī)制。方法:運用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)純化Wsitar大鼠BMSCs，誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，觀察補(bǔ)腎中藥、化痰中藥和補(bǔ)腎化痰中藥分別對BMSCs成骨分化后茜素紅染色及定量、堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OCN)mRNA表達(dá)影響。結(jié)果:補(bǔ)腎化痰中藥能促進(jìn)BMSCs成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞體外鈣化，提高細(xì)胞內(nèi)ALP活性，上調(diào)OCN-mRNA表達(dá)。結(jié)論:補(bǔ)腎化痰法可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

補(bǔ)腎化痰法;骨質(zhì)疏松癥;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨分化

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

L-DMEM，美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)，澳大利亞 Maverick公司;CD29-FITC、CD45-PE、CD44-FITC，美國 BioLegend公司;二甲基亞楓(DMSO)、地塞米松(DEX)、維生素C、β-甘油磷酸鈉(β-GP)，Invitrogen公司;RT-PCR 試劑盒，F(xiàn)ermentas公司;堿性磷酸酶染色液(BCIP/NBT)，美國Maxim Biotech公司;蛋白定量的試劑盒(lowry 法)，Bio Rad公司;FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)、PCR擴(kuò)增儀(Biometra公司)、紫外分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 中藥干預(yù)液的配制

補(bǔ)腎化痰中藥組:淫羊藿、補(bǔ)骨脂、全栝樓、紅曲、山楂;補(bǔ)腎中藥組:淫羊藿、補(bǔ)骨脂;化痰中藥組:全栝樓、紅曲、山楂。將上述各組中藥復(fù)方經(jīng)水煮、醇沉，濃縮成每毫升相當(dāng)于原中藥材1 g的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用前先用濾紙初濾，再用0.22 μm過濾除菌、分裝，－20℃保存。

1.3 BMSCs分離、培養(yǎng)與傳代

全骨髓貼壁法:6～8周齡雄性Wistar大鼠，分離大鼠兩側(cè)股骨和脛骨，用含10%FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，將細(xì)胞懸液移至離心管，200 g離心5 min棄上清。用2～3 ml的 LDMEM完全培養(yǎng)基(含L-DMEM培養(yǎng)基，10%FBS，青霉素、鏈霉素各100 U/ml)重懸細(xì)胞，接種到T25塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后首次全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞。此后每3 d更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.4 BMSCs鑒定

形態(tài)學(xué)觀察，即逐日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。BMSCs表面標(biāo)志物的測定，即用流式細(xì)胞儀檢測P4代BMSCs表面CD29、CD44和CD45單克隆抗體表達(dá)。

打開國家工商行政管理總局商標(biāo)局的中國商標(biāo)網(wǎng)，在相似商標(biāo)國際分類第一類中，隨意輸入國內(nèi)一線的化肥商標(biāo)，就可以查詢出諸多相似商標(biāo)，多數(shù)僅一字之差。記者以“紅四方”商標(biāo)為例，查詢時發(fā)現(xiàn)，與之一字之差的商標(biāo)還有“四方”“四紅方”“紅方”“紅遍四方”等多個與之類似的商標(biāo)，這些商標(biāo)多數(shù)用于化肥行業(yè)。除了“四紅方”與“紅四方”的申請人均為中鹽安徽紅四方股份有限公司外，其他相似商標(biāo)的申請人則是不同的公司和個人。再以“史丹利”進(jìn)行搜索，則發(fā)現(xiàn)一字之差的商標(biāo)依舊很多，如“史丹臣”“史沛利”“綠丹利”等，這些商標(biāo)均屬于不同公司。

1.5 補(bǔ)腎化痰中藥對BMSCs誘導(dǎo)成骨分化的影響

將P4代BMSCs按4×103/cm2密度接種于6孔板，細(xì)胞融合達(dá)60%～70%后加入成骨分化培養(yǎng)基(含10－7mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μg/ml Vitamin C)，置培養(yǎng)箱中隔天換液1次。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別加入0.01%補(bǔ)腎化痰中藥干預(yù)液、補(bǔ)腎中藥干預(yù)液、化痰中藥干預(yù)液，分為補(bǔ)腎化痰中藥組、補(bǔ)腎中藥組、化痰中藥組。BMSCs成骨誘導(dǎo)18 d后終止誘導(dǎo)，并進(jìn)行下列各項指標(biāo)檢測。

1．5．1 茜素紅染色及定量 用10%中性甲醛固定15min，加入0.5%的茜素紅染色液染色20 min，蒸餾水洗滌4次，分光光度法測定吸光度(OD 值)，茜素紅定量以umol/mg表示。

1．5．2 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 用常規(guī)生化分析儀測定ALP活性。

1．5．3 骨鈣素(OCN)mRNA表達(dá) 用0.25%胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA)消化收集細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說明進(jìn)行總RNA的抽提。引物設(shè)計: β-actin，上游引物:5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’;下游引物:5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’。OCN:上游引物:5’-ATG AGA GCC CTC ACA CTC-CTC-3’，下游引物:5’-GCC GTA GAA GCG CCG ATA GGC-3’。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA后貯于－20℃?zhèn)溆?。PCR體積30 μL，包括cDNA模板1.2 μL，10×Buffer 3 μL，dNTP (0.2 mM)3 μL，MgCl2(25 mM)2 μL，上游引物:(10 μM)1 μL，下游引物:(10 μM)1 μl，Taq酶(1 U/ μL)2 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至30 μL?；靹蚝箅x心數(shù)秒，置PCR儀上，熱循環(huán)程序為:預(yù)變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火60℃1 min，延伸72℃1 min，30個循環(huán)后72℃再延伸10 min。取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測溴化乙錠染色的凝膠，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)掃描存盤。記錄各條帶積分光密度(IOD)，將檢測基因與GAPDH條帶IOD相比較得到其相對IOD。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs及成骨誘導(dǎo)分化后形態(tài)學(xué)特征

接種后，BMSCs呈圓形，胞體透亮，折光性強(qiáng)，大小不一。72 h首次換液后即可見大量貼壁細(xì)胞，細(xì)胞完全舒展并呈現(xiàn)長梭形、三角形、多邊形等多種形態(tài)，帶2～3個突起。4～7 d呈放射狀生長的貼壁細(xì)胞形成數(shù)個不同大小、分散的細(xì)胞集落。9～10 d細(xì)胞逐漸融合成片，沿胞體長軸有序排列，呈旋渦狀(圖1)。傳代后的細(xì)胞形態(tài)單一均勻，融合后呈典型的極性，漩渦狀生長。成骨誘導(dǎo)第2天開始，即可見部分細(xì)胞由長梭形逐漸變?yōu)榱⒎叫?，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切吻殷w積增大。培養(yǎng)8 d后，細(xì)胞持續(xù)增殖，呈多層重疊生長，逐漸聚集形成多個散在致密的島狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并逐漸被細(xì)胞分泌的基質(zhì)所包埋，13 d左右出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)，其后還可見到明顯的鈣沉積(圖2)。

圖1 BMSCs原代培養(yǎng)結(jié)果(×40)

圖2 BMSCs傳代培養(yǎng)(×200)

2.2 大鼠BMSCs表面標(biāo)志物檢測

細(xì)胞表面抗原CD29、CD44的陽性率分別為99.64%和98.52%，CD45的陽性率為1.54%。

2.3 補(bǔ)腎化痰方對BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅S染色與定量、ALP活性、OCN-mRNA表達(dá)的影響

表1圖3顯示，用茜素紅S染色后礦化結(jié)節(jié)呈橘紅色。各組OCN-mRNA表達(dá)的電泳圖，見圖4。補(bǔ)腎化痰中藥組BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅S定量值、ALP活性、OCN-mRNA表達(dá)均高于經(jīng)典誘導(dǎo)組(P＜0.05，P＜0.001)。補(bǔ)腎中藥組和化痰中藥組與經(jīng)典誘導(dǎo)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 細(xì)胞礦化作用檢測結(jié)果(×200)

圖4OCN-mRNA瓊脂糖電泳結(jié)果

表1 各組BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅定量、ALP活性及OCN-mRNA表達(dá)的檢測結(jié)果(n=3±s)

表1 各組BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅定量、ALP活性及OCN-mRNA表達(dá)的檢測結(jié)果(n=3±s)

注:與經(jīng)典誘導(dǎo)組比較:*P＜0.05，＊＊＊P＜0.001

組別 茜素紅定量(μmol/mg)-actin經(jīng)典誘導(dǎo)組ALP活性(nmol/mg) OCN/β 12.605±0.847 3406.650±5．734 0.384±0.131補(bǔ)腎化痰中藥組 15.568±2.310*4265.287±41．735＊＊＊1.080±0.356＊＊＊補(bǔ) 腎 中 藥 組 11.277±0.489 3580.569±8．797 0.588±0.327化 痰 中 藥 組12.626±1.221 3044.010±5．581 0.549±0.079

3 討論

BMSCs是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種起源于中胚層、具有自我復(fù)制和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，能在不同的誘導(dǎo)條件下分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等成熟的間質(zhì)細(xì)胞［2］。BMSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化保持正常的比例關(guān)系，對維持骨組織重建與代謝發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。一旦BMSCs過多地向成脂細(xì)胞方向分化，則向成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞數(shù)就相應(yīng)減少，進(jìn)而引起成骨缺陷。研究表明，各種原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松和骨量減少，如卵巢切除、長期制動、酒精、糖皮質(zhì)激素應(yīng)用等，多伴有骨髓脂肪細(xì)胞的增多［3］。隨著年齡的增長，骨量不斷丟失的同時，骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞的體積、數(shù)目均呈直線性增加［4］，尤其是四周骨髓的骨髓腔約90%被脂肪細(xì)胞占據(jù)。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的BMSCs成骨分化能力減弱，更易于向脂肪細(xì)胞分化［5］。因此，研究調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化、抑制向脂肪細(xì)胞分化的基因及藥物是骨質(zhì)疏松癥防治的重要方向。

我們從脂代謝紊亂與骨質(zhì)疏松癥存在密切聯(lián)系出發(fā)，認(rèn)為腎虛是骨質(zhì)疏松癥的病理基礎(chǔ)，痰濁是骨質(zhì)疏松癥的致病因素之一，提出脂代謝異常可能與骨質(zhì)疏松癥痰濁有關(guān)的假說，并制定了補(bǔ)腎化痰的新治則［6］。補(bǔ)腎化痰方由淫羊藿、補(bǔ)骨脂、全栝樓、山楂、紅曲5味藥組成。方中淫羊藿，《本草綱目》稱其有“益精氣，強(qiáng)筋骨，補(bǔ)腰膝”作用，為溫腎壯陽之要藥;補(bǔ)骨脂具有補(bǔ)腎壯陽、固精縮尿、溫脾止瀉的功效，兩藥相合補(bǔ)腎壯骨，是為君藥。方中全栝樓功可清熱化痰為臣藥;山楂善于消食化積、行氣散瘀;紅曲健脾消食、活血化瘀，二藥協(xié)同為佐藥，全方共奏補(bǔ)腎化痰之功。

成骨細(xì)胞在鈣化條件培養(yǎng)下，具有體外礦化特點，用茜素紅S染色可見橘紅色鈣結(jié)節(jié)，可作為成骨細(xì)胞的一種標(biāo)志。ALP是一種較為肯定的參與促進(jìn)鈣化活動的酶類，它是一種細(xì)胞內(nèi)酶，其活性作為早期成骨性分化指標(biāo)在骨代謝研究中被廣泛應(yīng)用。OCN是晚期成骨性誘導(dǎo)的關(guān)鍵性標(biāo)志，對骨骼的改建過程有重要的調(diào)節(jié)功能。本實驗結(jié)果表明，補(bǔ)腎化痰中藥組BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅S定量值、ALP活性、OCN-mRNA表達(dá)均高于經(jīng)典誘導(dǎo)組，而補(bǔ)腎中藥組和化痰中藥組與經(jīng)典誘導(dǎo)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示補(bǔ)腎化痰中藥在促進(jìn)BMSCs早期和晚期成骨性分化方面均具有作用。

［1］ Kha HT，Basseri B，Shouhed D，et al．Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells:probone and antifat ［J］．J Bone Miner Res，2004，19(5):830．

［2］ MingueU JJ，Erices A，Conget P．Mesenchymal stem cells［J］．Exp Biol Med，2001，226(6):507-520．

［3］ 郭坤亮，安洪，蔣電明，等．早期酒精性股骨頭缺血壞死骨細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，28(3): 313-315．

［4］ 李湘輝，陸志堅，張金超，等．阿倫磷酸鈉對小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨和成脂分化的影響［J］．中國藥理學(xué)報，2006，22(6): 671-674．

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［6］ 周亞娜，向楠．從“痰”論治骨質(zhì)疏松癥［J］．湖北中醫(yī)雜志，2013，35(12):36-38．

Experimental study of tonifying kidney and resolving phlegm methods on influencing the bone marrow mesenchymal stem cells osteogenic differentiation

ZHOU Ya-na1，XIANG Nan2△，CHEN Hui2
(1．Hubei provincial hospital of TCM，Wuhan 430061，China;2．Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China)

Objective:It observed the osteoblastic differentiation of BMSCs on Bushen Therapy，Huatan Therapy，Bushen Huatan Therapy，and explore the mechanism of Bushen Huatan Therapy of treating osteoporosis．Method:BMSCs of wistar rats were isolated，purified by using whole bone marrow adherent method and identified by cytomorphology and morphologic characteristics，surface antigensdetected by flow cytometer．BMSCswasinduced by osteoblastic differentiation．Through the detection of alizarin red staining and quantitative，the ALP activity and the expression of OCN-mRNA，it explored the effect of osteoblastic differenttiation of BMSCs on Bushen Therapy，Huatan Therapy，Bushen Huatan Therapy．Results:Using the whole bone marrow adherent method can get good，stable and heterogeneity of BMSCs．Bushen Huatan Herb can promote BMSCs to generate into osteoblast in vitro calcification，increase the activity of ALP，down-regulate theexpression ofOCN-mRNA．Conclusion: Bushen Huatan Treatmentcan promote osteoblastic differentiation of BMSCs．

Bushen Huatan Treatment;Osteoporosis;Bone mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation

R274．9

B

1006-3250(2015)03-0275-03

2014-11-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(30672591);湖北省自然科學(xué)基金資助項目(2007ABA237)。

周亞娜(1980-)，女，湖北襄陽人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝疾病和內(nèi)分泌腫瘤的臨床與研究。

△通訊作者:向 楠，教授，博士研究生導(dǎo)師，第一批全國中醫(yī)藥優(yōu)秀臨床人才，全國老中醫(yī)經(jīng)驗繼承人，Tel: 13007162959，E-mail:xiangnan61@sina．com。