商 震，程建姝

(山東省濟(jì)南市第三人民醫(yī)院，濟(jì)南 250101)

固定配方加引經(jīng)藥牛膝對防治兔股骨頭壞死的作用機(jī)制研究

商 震，程建姝

(山東省濟(jì)南市第三人民醫(yī)院，濟(jì)南 250101)

目的:探討中藥固定配方補氣生骨方加引經(jīng)藥牛膝對兔股骨頭壞死的修復(fù)作用并對其機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法:通過大腸桿菌內(nèi)毒素聯(lián)合氫化潑尼松龍制作激素性兔股骨頭壞死模型，用補氣生骨方并分別加引經(jīng)藥牛膝和獨活治療股骨頭壞死，觀察血管分布、組織病理學(xué)變化，檢測血清中IGF-1含量及血管VEGF的表達(dá)。結(jié)果:2周、4周、8周時牛膝組血管面積與模型組比較增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，均大于固定配方組與獨活組。病理學(xué)觀察該方加引經(jīng)藥牛膝可使骨小梁間隙降低，厚度和體積增加，空骨陷窩率下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，均小于固定配方組和獨活組，并可明顯提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表達(dá)水平。結(jié)論:補氣生骨方加引經(jīng)藥牛膝可通過提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表達(dá)水平來促進(jìn)股骨頭壞死的修復(fù)，其中引經(jīng)藥對于藥物作用的發(fā)揮起到了重要引導(dǎo)作用。

引經(jīng)藥;牛膝;股骨頭壞死

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由多種因素引發(fā)的血液運輸障礙(缺血性壞死)而導(dǎo)致骨內(nèi)部組織壞死的一種病癥，是一種常見、多發(fā)、難治的骨科臨床?。?-2］。目前該病可采用中西醫(yī)治療方法，西醫(yī)以手術(shù)治療為主，但其臨床治療效果并不滿意［3］。中藥在該病的早中期治療中起到一定的延緩作用，并具有一定的優(yōu)勢。中藥治療主要基于活血化瘀論、壯骨補腎論［4］。常用的中藥配方有補腎活血湯、生骨再造湯、活骨生骨方、補氣生骨方等［5-7］，許多學(xué)者主張兩者并重?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對該病進(jìn)行了細(xì)胞因子調(diào)控、分子機(jī)制等方面的研究，并取得一定成果。而在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥方面多側(cè)重于基礎(chǔ)理論、中醫(yī)辨證治療，其深度和廣度還有待進(jìn)一步提高。

本研究通過低劑量脂多糖(LPS)聯(lián)合氫化潑尼松龍制作激素性兔股骨頭壞死模型，采用固定配方補氣生骨方并加引經(jīng)藥牛膝治療兔股骨頭壞死，觀察血管分布、組織病理學(xué)變化，通過檢測血清中胰島素生長因子-1(insulin growth factor，IGF-1)含量及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，對其作用機(jī)制進(jìn)行分子水平的研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級健康成年雄性新西蘭大白兔60只，體質(zhì)量(2.5±0.3)kg，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心提供，單籠飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

大腸桿菌內(nèi)毒素(美國，sigma);醋酸氫化潑尼松龍(山東，辰欣藥業(yè));青霉素鈉(北京，Solarbio); SABC免疫組化試劑盒、IGF-1酶聯(lián)免疫試劑盒(南京，建成);VEGF單克隆抗體(美國，Millipore)。生物組織包埋機(jī)(KD-BM，浙江科迪儀器)、切片機(jī)(RM 2016，上海徠卡)、醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(CT2-BI-2000，中國北航)。

1.3 方法

1.3.1 動物造模與分組 48只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素(5 ug/kg)，24 h后重復(fù)給藥，同時肌注醋酸氫化潑尼松龍(30 mg/kg)連續(xù)4 d，每天注射20萬單位的青霉素鈉以防感染。通過CT掃描篩選出造模成功的動物，并按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、固定配方組、牛膝組、獨活組4組，同時另12只作為正常對照組。固定配方組每天灌胃補氣生骨方水煎劑，牛膝組灌胃補氣生骨方水煎劑加牛膝(0.75 g·kg-1·d-1)，獨活組灌胃補氣生骨方水煎藥加獨活(0.75 g·kg-1·d-1)，模型組和正常組給予相同劑量的生理鹽水。

1.3.2 墨汁灌注血管觀察 分別于給藥2周、4周、8周時用3%戊巴比妥鈉麻醉動物(30 mg/ kg)，于腹部切口，剝離暴露腹主動脈和下腔靜脈，插上導(dǎo)管立即注入肝素，然后加壓注入生理鹽水，直至下腔靜脈流出的液體澄清，最后注入墨汁直至兔雙下肢發(fā)黑。取雙側(cè)股骨頭剔除冗余組織，甲醛固定，鹽酸甲酸脫鈣，梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋、透明、切片，于光鏡下觀察血管分布及形態(tài)變化，通過醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算血管面積。

1.3.3 組織病理學(xué)觀察 分別于給藥2周、4周、8周時處死動物取雙側(cè)股骨頭，剔除冗余組織，甲醛固定，鹽酸甲酸脫鈣，梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋、透明、切片，HE染色觀察其病理學(xué)變化。高倍鏡下選取100個骨陷窩計算空骨陷窩率。

1.3.4 血清中IGF-1的測定 于2周、4周、8周時空腹?fàn)顟B(tài)下兔耳后中央動脈取血，離心取上清，-20℃保存。按IGF-1酶聯(lián)免疫試劑盒所述方法測定各組不同時間點血清中IGF-1的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得IGF-1濃度。

1.3.5 免疫組化VEGF染色 按試劑盒說明將各組2周、4周、8周時的石蠟切片進(jìn)行脫蠟，過氧化氫洗滌，抗原熱修復(fù)，PBS清洗，山羊血清封閉液封閉，依次加入一抗、二抗、SABC，最后DAB顯色劑顯色。通過醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對VEGF的表達(dá)進(jìn)行分析，選取多個視野求得平均值，對表達(dá)陽性細(xì)胞計數(shù)。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 墨汁灌注血管觀察結(jié)果

表1顯示，光鏡下觀察墨汁灌注切片可見，正常組血管被均勻染成黑色并呈網(wǎng)狀。模型組血管稀疏、紊亂，部分出現(xiàn)血栓現(xiàn)象，其面積小于正常組，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。給藥后3組給藥組血管面積均有所增加;4周、8周時牛膝組血管面積與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);獨活組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且4周、8周時牛膝組血管面積均大于固定配方組與獨活組。

表1 各組髓腔中血管面積的比較(±s，μm2)

表1 各組髓腔中血管面積的比較(±s，μm2)

注:與正常組比較:aaP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05，bbP＜0.01

組 別 例數(shù) 2周 4周 8周4 255.1±12.3 268.4±34.5 277.8±21.6模 型 組 4 164.2±13.9aa145.9±21.8aa 144.6±18.9aa固定配方組 4 184.6±9.08 199.5±33.0b 203.2±30.1bb牛 膝 組 4 213.4±21.3b 235.8±14.7bb 253.6±24.5bb獨 活 組 4 221.6±18.7b 230.7±22.2b 241.9±19.6正常組b

2.2 組織病理學(xué)觀察結(jié)果

圖1表2顯示，造模成功的股骨頭組織切片可見，骨小梁稀疏，出現(xiàn)萎縮和連續(xù)性中斷現(xiàn)象;骨髓壞死，造血組織明顯減少，髓腔脂肪變性、纖維化;空骨陷窩率增加;破骨細(xì)胞增多，骨細(xì)胞核皺縮。與模型組比較，給予補氣生骨方治療后骨小梁間隙降低，厚度和體積有所增加，空骨陷窩率下降，在2周、4周、8周時與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;牛膝組與獨活組空骨陷窩率與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且牛膝組均大于固定配方組和獨活組。

表2 各組兔血清中IGF-1含量比較(±s，ng/ml)

表2 各組兔血清中IGF-1含量比較(±s，ng/ml)

注:與正常組比較:aaP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05，bbP＜0.01

組 別例數(shù) 2周 4周 8周4 22.12±0.51 19.62±3.45 20.57±2.16模 型 組 4 12.29±2.12aa 14.52±0.83aa 13.46±1.46a固定配方組 4 14.87±3.03 15.98±0.84 18.45±2.18bb牛 膝 組 4 15.74±2.19b 16.25±2.34b 19.43±1.47bb獨 活 組 4 16.02±2.17b 16.66±1.62b 18.51±0.54正 常 組b

2.3 血清中IGF-1的變化

與正常組比較，3個時間點模型組血清中IGF-1含量均下降，2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，3個實驗組IGF-1含量均上升，在8周時，固定配方組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);在2周、4周時，牛膝組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);在2周、4周、8周時獨活組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。上述結(jié)果顯示，給藥組可以提高血清中IGF-1含量，其中牛膝組作用最明顯，獨活組為其次。

圖1 實驗4周時各組股骨頭組織病理切片觀察(100×)

圖2 各組股骨頭空骨陷窩率比較

2.4 VEGF免疫組化結(jié)果

光鏡下可見，各組免疫組化切片成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、造血細(xì)胞中均有VEGF的表達(dá)。與正常組比較，各個時間點模型組VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，3組給藥組陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目均增加，在2周時與模型組比較，牛膝組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在4周、8周時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);固定配方組、獨活組在4周、8周時與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，總體比較結(jié)果為正常組＞牛膝組＞獨活組＞固定配方組＞模型組。

表3 各組免疫組化VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)目比較(±s)

表3 各組免疫組化VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)目比較(±s)

注:與正常組比較:aaP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05，bbP＜0.01

組 別 例數(shù) 2周 4周 8周4 201±12.0 189±22 221±16模 型 組 4 122±11.0aa 103±34aa 117±12aa固定配方組 4 132± 8.0 145±42b 168±29b牛 膝 組 4 152±21.3b 178±14bb 209±25bb獨 活 組 4 144±36.0 166±13b 189±19正常組b

3 討論

補氣生骨方(黃芪、白芷、穿山甲、何首烏)中的黃芪甘溫可益氣生血為主藥;白芷性溫可散風(fēng)祛濕、通竅止痛;穿山甲咸寒入肝經(jīng)可解痙攣、止疼痛、祛風(fēng)通絡(luò);何首烏甘苦可補肝腎、強筋骨、益精血，諸藥結(jié)合使用，具有補氣養(yǎng)血、通絡(luò)除痹的功效［7］。引經(jīng)藥具有一定的向?qū)ё饔茫?］，牛膝所含的化學(xué)活性物質(zhì)多，藥理作用較多，作為引經(jīng)藥具有活血下行的功效，可補肝腎、強筋骨，改善缺血狀態(tài)，促進(jìn)骨組織修復(fù)［9］。股骨頭壞死是一種缺血性壞死，其病變與血管及血液運輸密切相關(guān)，而VEGF是目前所知惟一特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的生長因子［10-11］，同時VEGF可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨修復(fù)［12-13］。有研究證明，血清中的IGF-1作用于骨細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)皮生長因子，從而促進(jìn)其增殖，并加快新生血管的生長，對軟骨細(xì)胞的分裂增殖與功能代謝也有影響［14-15］。

為探討中藥配方及引經(jīng)藥對股骨頭壞死的作用及機(jī)制，本研究以單獨補氣生骨方中藥及引經(jīng)藥獨活為對照，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察及一些指標(biāo)測定。結(jié)果表明，補氣生骨方對早中期股骨頭壞死具有一定的預(yù)防及緩解作用，加入引經(jīng)藥牛膝和獨活后其作用增強，表現(xiàn)為骨小梁間隙降低，厚度和體積有所增加，骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和血管數(shù)量等增多。通過測定血清中IGF-1含量以及VEGF的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，補氣生骨方加引經(jīng)藥牛膝可明顯提高 IGF-1及VEGF水平，從而刺激血管新生，促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化，對股骨頭壞死起到一定的修復(fù)作用。牛膝引導(dǎo)各中藥成分充分發(fā)揮作用，與引經(jīng)藥獨活相比，其引導(dǎo)作用更強。

綜上所述，補氣生骨方加引經(jīng)藥牛膝可通過提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表達(dá)水平來促進(jìn)股骨頭的壞死，其中引經(jīng)藥牛膝對于藥物作用的發(fā)揮起到了重要的引導(dǎo)作用。

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Effects and Mechanism Research on the Fixed Recipe Plus Channel Ushering Drug of Achyranthes Bidentata on the Prevention and Treatment of Rabbit Femoral Osteonecrosis

SHANG Zhen，CHENG Jian-shu
(No.People's Hospital Jinan City，Shandong Province，Jinan 250101，China)

Objective:To study the effect and mechanisms of fixed formula with channel ushering drug-achyranthes on the osteonecrosis of the femoral head.Methods:The hormone-induced osteonecrosis of femoral head model was made by Escherichia coli endotoxin and hydrogenated prednisolone in rabbits，and they were treated with replenishing Qi and producing bone formula combining with different channel ushering drugs-achyranthes and pubescent angelica.The vascular distribution and histopathological changes were observed，the level of IGF-1 in serum and the expression of VEGF were detected.Results:The vascular area of achyranthes group was increased and was significantly different when compared with model group at the 2nd，4thand 8thweeks.It was also higher than the fixed formula group and pubescent angelica group.Histopathological observations showed that the mean space of trabecular bone reduced and thickness and volume increased.The ratio of empty lacuna declined significantly when compared with model group，and was smaller than fixed formula group and pubescent angelica group.The level of IGF-1 in serum and the expression of VEGF were increased significantly.Conclusion:The fixed formula with achyranthes can promote the healing of osteonecrosis of the femoral head by increasing the levels of IGF-1 in serum and the expression of VEGF，in which the channel ushering drug achyranthes plays an important guiding role.

Channel ushering drug;Achyranthes;Osteonecrosis of the femoral head

R683.41

:B

:1006-3250(2015)07-0803-03

2015-05-19

商 震(1974-)，男，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事骨外科的臨床與研究。