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參松養(yǎng)心膠囊對大鼠心室肌細胞L-型鈣電流和鉀電流的抑制作用

2015-04-11 05:59:54程林忠程瑜蓉
關(guān)鍵詞:失活養(yǎng)心心室

程林忠,程瑜蓉,李 青△

(1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)院,太原 030001;2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院,北京 100020)

參松養(yǎng)心膠囊對大鼠心室肌細胞L-型鈣電流和鉀電流的抑制作用

程林忠1,程瑜蓉2,李 青1△

(1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)院,太原 030001;2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院,北京 100020)

目的:探討參松養(yǎng)心膠囊對大鼠心室肌細胞L-型鈣電流(Ica,L)和瞬時外向鉀電流(Ito)的抑制作用。方法:酶解法分離大鼠心室肌細胞,使用參松養(yǎng)心溶液(0.5 mg/100 mL,0.5%)灌流心室肌細胞,利用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄Ica,L和Ito,在細胞破膜后的20 min內(nèi)記錄所有數(shù)據(jù),對每個細胞給藥前后做自身對照,觀察參松養(yǎng)心溶液對Ica,L和Ito通道電流的影響。結(jié)果:0.5%的參松養(yǎng)心溶液對Ica,L和Ito均有抑制作用,參松養(yǎng)心溶液對Ito的緩慢電流成分Itos無明顯作用,但可以明顯抑制Ito的快速電流成分Itof。在-10 mV測試電壓下,在0.5%的參松養(yǎng)心溶液作用后,Ica,L的最大激活峰值電流密度從(-8.64+-2.43)pA/pF降為(-5.92+-2.15)pA/pF,抑制率為31.85%+10.25%,電流密度-電壓(I-V)曲線上移;在-60 mV測試電壓下,在0.5%的參松養(yǎng)心溶液作用后,Itof的最大激活峰值電流密度從(23.53+3.31)pA/pF降為(16.86+2.34)pA/pF,抑制率為(28.33+10.59)%,I-V曲線下移。參松養(yǎng)心溶液不改變Ica,L的通道動力學,但會使Ito通道失活后的恢復變慢。結(jié)論:參松養(yǎng)心溶液對Ica,L和Ito均有明顯的抑制作用。

參松養(yǎng)心膠囊;L-型鈣電流;瞬時外向鉀電流;抑制

參松養(yǎng)心膠囊是由甘松、麥冬、人參等12種中藥組成的通絡復方制劑。參松養(yǎng)心膠囊不僅可以實現(xiàn)心臟自主神經(jīng)的調(diào)節(jié),而且可以改善心臟傳導系統(tǒng)和心肌細胞的代謝,抑制心肌細胞的自律性,具有良好的抗心律失常作用[1]。有研究報道,參松養(yǎng)心膠囊可明顯減少缺血再灌注所致心率失常的發(fā)生,并對藥物誘發(fā)的心率失常具有顯著的抑制作用[2]。同時有研究證明,采取多中心隨機對照臨床試驗,患者的室性早搏癥狀在服用參松膠囊后會有所減輕,且患者出現(xiàn)的心臟副作用并不明顯[3]。但目前并沒有對參松養(yǎng)心膠囊抗心律失常機制的報道。本研究利用全細胞膜片鉗記錄方法,探究參松養(yǎng)心膠囊對不同心肌離子通道的影響,結(jié)果提示參松養(yǎng)心膠囊溶液對心肌多種離子通道均有不同程度的抑制作用,可以實現(xiàn)抗心律失常作用,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與溶液

參松養(yǎng)心膠囊由河北石家莊以嶺藥業(yè)有限公司提供。胰蛋白酶E購自Merck公司,II型膠原酶購自Gibico公司。乙二醇-雙四乙酸(EGTA)、N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、L-谷氨酸、葡萄糖、氯化膽堿、K2ATP、?;撬帷gATP、氯化銫、Na2ATP、CaCl2由Sigma公司提供。4-氨基吡啶(4-AP)、氯化四乙胺(TEA-Cl)由Fluka公司提供,其他常規(guī)試劑由北京化學試劑公司提供,均為分析純。

溶液:①0.5%參松養(yǎng)心膠囊溶液:參松養(yǎng)心干粉用無KCl的細胞外灌流液溶解,所配制溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.5%,然后把K+濃度調(diào)整為5.4 mmol/L,離心后去上層溶液備用;②KB液(mmol/ L):80 KOH、40 KCl、3.0 MgSO4、50 L-谷氨酸、20?;撬?、10 HEPES、10葡萄糖、0.5 EGTA,NaOH調(diào)至pH=7.4;③無鈣臺氏液(mmol/L):5.4 KCl、136 NaCl、1.0 MgCl2、0.33 NaH2PO4、10 HEPES、10葡萄糖,NaOH調(diào)至 pH=7.4;④Ica,L電極內(nèi)液(mmol/ L):1.0 MgCl2、5.0 MgATP、120 CsCl、10 EGTA、10 HEPES,CsOH調(diào)至pH=7.3;⑤Ito電極內(nèi)液(mmol/ L):1.0 MgCl2、20 KCl、5.0 HEPES、4.0K2ATP、10 EGTA、2.0磷酸肌酸二鈉,KOH調(diào)至pH=7.4;⑥Ica,L細胞外液(mmol/L):1.0 Mg2Cl、2.0 CaCl2、5.0 HEPES、10葡萄糖、4.6 CsCl、10 TEA-Cl、140 Choline-Cl,KOH調(diào)至 pH=7.4;⑦Ito細胞外液(mmol/L):1.2 Mg2Cl、5.4 KCl、1.8 CaCl2、10.0 HEPES、10葡萄糖、0.15 CdCl2、0.33 NaH2PO4、136 Choline-Cl,CsOH調(diào)至pH=7.3。

1.2 分離大鼠心室肌細胞

本實驗所用動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,體質(zhì)量在250~300 g,均為SD雄性大鼠。以參考文獻并對此方法加以改進后[4],將大鼠心室肌細胞分離出來。大鼠在使用50 mg/kg戊巴比妥鈉充分麻醉后,迅速開胸將心臟分離出來,利用Langenforf系統(tǒng)灌流心臟,將左右心房及心耳剪去。灌流液為含0.05 mmol/L CaCl2低鈣酶解液,另含II型膠原酶0.4 mg/mL和蛋白酶 E 0.04 mg/ mL,整個灌流時間持續(xù)30~50 min,整個過程保持對心臟的不間斷觀察。每間隔5 min,將小塊的心室肌剪下,在充分氧飽和的KB液中輕輕吹打,將單個心室肌細胞分離出來。對心室肌的形態(tài)和數(shù)量利用顯微鏡觀察,將橫紋清晰、邊緣清晰、70%以上存活率細胞保持、備用。

1.3 利用全細胞膜片鉗技術(shù)讀取心肌細胞電流

室溫下,利用 Hamill標準全細胞膜片鉗方法[5],記錄邊緣清晰、橫紋清晰的單個細胞通道電流。開始實驗前制備薄壁電極,此過程中使用到p-97玻璃電極拉制儀(美國sutter公司)。另外,對電極尖端利用MF-830拋光儀(日本Narishige公司)進行拋光,灌注電極內(nèi)液后,將入液電阻維持在1.5~2.0 MΩ之間。此外,實驗中還利用Axopatch 700B膜片鉗放大器(美國Axon公司),數(shù)據(jù)的記錄采用pClampex10.0軟件(美國Axon公司)。在細胞破膜后,為維持細胞膜的穩(wěn)定性,不斷給予控制在-50~-60 mV的連續(xù)刺激,對整個實驗過程中的細胞電容進行記錄和計算,并將細胞間的電流密度進行比較。

刺激方案:①記錄Ito:測試電位(Vt)=-40~60 mV,維持電位(VH)=-80 mV,階躍10 mV,保持400 ms的鉗制時間;②記錄Ica,L:測試電位(Vt)=-60~60 mV,維持電位(VH)=-80 mV,階躍10 mV,保持240 ms的鉗制時間;③記錄Ito和Ica,L通道的電壓依賴性失活:將細胞膜電位維持在-70 mV,從-60~40 mV的范圍內(nèi)階躍,同時給予10 mV的前刺激,刺激維持1000 ms,給予持續(xù)250 ms去極化至10 mv測試電壓記錄Ica,L通道的失活;將細胞膜電位維持在-90 mV,從-120~60 mV的范圍內(nèi)階躍,同時給予10 mV的前刺激,將60 mv的測試電壓維持300 ms,記錄此過程中Ito通道的失活。橫坐標為前刺激電壓,縱坐標為峰電流與標準化最大電流的比值(I/Imax),繪制穩(wěn)態(tài)失活曲線,并用Boltzman方程擬合求出失活半電壓(V1/2)和斜率k;記錄Ito和Ica,L通道的時間依賴性失活:給予雙脈沖刺激,維持在-90 mV的電壓,同時為誘導Ito通道失活給予10 mV電壓鉗制脈沖,并持續(xù)250 ms,給予的鉗制脈沖要控制在不同的時間間隔,并對不同時間點對應的Ito峰電流幅值I進行記錄;采取雙脈沖刺激,維持在-90 mV的電壓,為誘導ICa,L通道失活,需給予2個同樣的10 mV刺激并持續(xù)250 ms,將兩刺激之間的差距維持在-70 mV間隔,對給予刺激的時間間隔逐漸延長,將第2次刺激對應的ICa,L峰電流記錄下來。穩(wěn)態(tài)失活后恢復曲線是依據(jù)I/Imax與時間之間的關(guān)系來構(gòu)建的,同時恢復曲線的時間常數(shù)τ是以單指數(shù)方程為最佳擬合曲線所得到的。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 ICa,L通道受參松養(yǎng)心膠囊的影響

2.1.1 ICa,LI-V曲線受參松養(yǎng)心膠囊的作用結(jié)果 圖1顯示,本研究中記錄所得到的大鼠心室肌細胞ICa,L是一組失活緩慢、激活快速的內(nèi)向電流。用0.5%的參松養(yǎng)心溶液灌流10 min后,在-60 mV~50 mV的Vt范圍內(nèi),ICa,L激活峰值電流密度從(-8.64+-2.43)pA/pF降為(-5.92+-2.15)pA/pF,抑制率為(31.85+10.25)%(n=10,P<0.05),電流密度-電壓(I-V)曲線上移。

2.1.2 ICa,L通道的電壓依賴性失活和失活后恢復受參松養(yǎng)心膠囊的影響 ICa,L通道的電壓依賴性失活和失活后恢復均受到參松養(yǎng)心溶液的影響。使用0.5%參松養(yǎng)心溶液前,ICa,L通道失活的V1/2為(-27.53+3.032)mV,斜率因子 k為(4.274+ 0.613);而使用后,ICa,L通道失活的V1/2(-31.43+ 4.115)mV,與作用前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),斜率因子k(4.080+0.393),作用前后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?;謴颓€的時間常數(shù)τ是以單指數(shù)方程為最佳擬合曲線所得,0.5%參松養(yǎng)心溶液作用前后的τ分別是(117.38+9.834)和(131.13+5.668)(n=10,P<0.05)。由此可見,ICa,L通道穩(wěn)態(tài)失活曲線在0.5%參松養(yǎng)心溶液的作用下呈現(xiàn)出左移的趨勢(圖2所示),同時ICa,L穩(wěn)態(tài)失活后的恢復緩慢(圖3所示)。

2.2 Ito通道受參松養(yǎng)心膠囊的影響

2.2.1 ItoI-V曲線受參松養(yǎng)心膠囊的作用圖4顯示,細胞內(nèi)外液將IK1被鉀電流阻斷后,利用Ito刺激方案記錄到的激活I(lǐng)to包括2種成分,即持續(xù)電流和峰值電流。用0.5%的參松養(yǎng)心溶液灌流10 min后,在-20 mV~60 mV的Vt范圍內(nèi),ICa,L最大峰值電流密度下降,從(23.53+3.31)pA/pF降為(16.86+2.34) pA/pF,抑制率為 (28.33+ 10.59)%(n=8,P<0.05),I-V曲線下移。

2.2.2 Ito通道的電壓依賴性失活和失活后恢復受參松養(yǎng)心膠囊的影響 Ito通道的電壓依賴性失活和失活后恢復均受到參松養(yǎng)心溶液的影響。使用0.5%參松養(yǎng)心溶液前,Ito通道失活的 V1/2為(-15.67+0.745)mV,斜率因子k為(4.838+0.233);而使用后,Ito通道失活的V1/2(-27.84+1.625)mV,斜率因子k為(9.634+0.247),作用前后V1/2和k差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0.5%參松養(yǎng)心溶液可使Ito通道失活曲線左移,斜率因子變大(圖5所示)?;謴颓€的時間常數(shù)τ是以單指數(shù)方程為最佳擬合曲線所得,0.5%參松養(yǎng)心溶液作用前后的τ從(14.15+0.584)增大到(18.90+1.106)(n=8,P<0.05),此結(jié)果說明Ito通道穩(wěn)態(tài)失活后恢復在0.5%參松養(yǎng)心溶液的作用下變得緩慢。

圖1 ICa,LI-V曲線受參松養(yǎng)心溶液的作用

圖2 ICa,L通道穩(wěn)態(tài)失活受參松養(yǎng)心溶液的影響

圖3 ICa,L通道穩(wěn)態(tài)失活后恢復受參松養(yǎng)心溶液的影響

3 討論

心率失常是由心肌電生理發(fā)生紊亂造成的。心率失常的發(fā)病機制通常可以歸結(jié)為異常的細胞膜離子泵結(jié)構(gòu)與功能,或者是因低氧缺血造成的心肌細胞能量代謝障礙,從而影響細胞膜對離子的轉(zhuǎn)運,改變了細胞內(nèi)外各種離子的濃度、分布以及流動性,最終在電生理上表現(xiàn)為心肌細胞興奮性、自律性和傳導性的改變,也就是心率失常[6]。

圖4 ItoI-V曲線受參松養(yǎng)心溶液的作用

圖5 Ito通道穩(wěn)態(tài)失活受參松養(yǎng)心溶液的影響

圖6 Ito通道穩(wěn)態(tài)失活后恢復受參松養(yǎng)心溶液的影響

ICa,L是引發(fā)細胞內(nèi)鈣釋放引起心肌收縮偶聯(lián)的主要離子流,影響著動作電位的時程[7]。然而,心肌缺血再灌注損傷的中心環(huán)節(jié)以及誘發(fā)缺血性心肌病的重要機制是細胞內(nèi)鈣超載。此外,心率失常發(fā)生的另一誘因就是動作電位復極不均一,可誘導跨心室壁不均一的復極,并在動作電位1期的形成中具有重要作用,導致另一重要離子流[8]Ito,它是具有快激活和失活特點的瞬時外向電流。目前臨床上,抗心律失常的藥物多是單離子通道抑制劑藥物在實現(xiàn)抗心率失常作用的同時,可能會有致心率失常發(fā)生的潛在性,具有明顯的副作用。與西藥相比,抗心律失常中藥不僅可以影響心臟離子通道的功能,而且由于中藥的復合成分使得其具有多離子通道靶點的作用特點,因此副作用小毒性低。其中,參松養(yǎng)心膠囊是一種常見的抗心率失常的純中藥制劑,該方中多數(shù)藥物均有較好的抗心率失常作用[9],如丹參、黃連、桑寄生中的丹參酮和黃連素成分,可以實現(xiàn)對心肌細胞外鈣離子內(nèi)流的阻滯,發(fā)揮異搏定樣作用;山茱萸中的氨基酸成分實現(xiàn)動作電位的延長,最終表現(xiàn)為心肌細胞自律性的降低。實驗證明,參松養(yǎng)心膠囊對心率失常具有明顯的療效,但目前并沒有對參松養(yǎng)心膠囊抗心律失常機制的報道[10]。本研究利用全細胞膜片鉗記錄方法,探究了參松養(yǎng)心膠囊對不同心肌離子通道的影響。

研究結(jié)果表明,0.5%的參松養(yǎng)心溶液對ICa,L和Ito均具有明顯的抑制作用。具體來說,0.5%的參松養(yǎng)心溶液可以使ICa,LI-V曲線上移,使失活曲線的V1/2降低以及失活后恢復時間延長,說明0.5%的參松養(yǎng)心溶液抑制ICa,L的作用,是對ICa,L通道的電壓依賴性失活和時間依賴性激活過程的門控影響來實現(xiàn)的。另外,0.5%的參松養(yǎng)心溶液可以降低Ito的峰值電流密度,I-V曲線下移,穩(wěn)態(tài)失活曲線左移,通道的失活加速,通道失活后的恢復時間也被延長。本實驗發(fā)現(xiàn),0.5%的參松養(yǎng)心溶液對ICa,L和Ito的抑制作用,可能是參松養(yǎng)心膠囊具有明顯抗心律失常作用而致心率失常副作用較小的原因之一。

綜上所述,參松養(yǎng)心膠囊具有明顯抗心律失常作用而致心率失常副作用較小,是一種較為理想的抗心律失常藥物。但本研究僅在離體大鼠心肌細胞水平上分析參松養(yǎng)心膠囊的電生理作用,關(guān)于參松養(yǎng)心膠囊的藥理作用還需要開展進一步的臨床和動物實驗,以揭示參松養(yǎng)心膠囊的安全性,為其廣泛應用提供理論和實踐基礎(chǔ)。

[1]張利娟,李常紅,盛懷湯.參松養(yǎng)心膠囊改善冠心病患者室性早搏的臨床觀察[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2013,19 (7):790-791.

[2]Lin Zhang,Jeff Kelley,Glen Schmeisser,et al.Complex formation between junction,triadin,calsequestrin,and the ryanodine.Proteins of the cardiac junctional sarcoplasmic reticulum membrane[J].J Biol Chem,1997,272(37): 23389-22297.

[3]冉玉琴,李寧,王蓉蓉,等.丹酚酸B對大鼠心室肌細胞瞬時外向鉀電流和L型鈣電流的阻滯作用[J].中國心臟起搏與心電生理雜志,2010,24(4):344-348.

[4]Hiroshi Irie,Junyuan Gao,Glenn R.Gandette,et al.Both metabolic inhibition and mitochondrial KATP channel opening are myoprotective and initiate a compensatory sarcolemmal outward membrane current[J].Circulation,2003,108(9):341-347.

[5]Haibo He,Mengqiong Shi,Xiaowei Zeng,et al.6 expression and enhanced endothelin receptor signaling associated with arrhymogenesis in myocardial infarction rat[J].Phytother Research,2008,22(8):1-11.

[6]陸潔,陸有為,孫玨,等.參松養(yǎng)心膠囊治療老年緩慢心率失常的療效評價[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2012,18 (12):1368-1370.

[7]Z.Papp,N.Peineau,G.Szigeti,J.Argibay and L.Kovacs.Calcimu-dependent modulation of the plateau phase of action potential in isolated ventricular cells of rabbit heart[J].Acta Physiol Scand,1999,167(2):119-129.

[8]Li GR,F(xiàn)eng J,Carrier M,et al.Transmural heterogeneity of action potential and Ito in myocytes isolated from the human right ventricle[J].Am J Physiol,1998,275(2):H369-H377.

[9]胡昊,唐海沁,李潔華,等.參松養(yǎng)心膠囊抗心律失常的療效和安全性系統(tǒng)評價[J].中國循證醫(yī)學雜志,2011,11 (2):168-173.

[10]蘇慶豐,張林虎.參松養(yǎng)心膠囊治療慢性心衰合并室性早搏[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2011,9(9):1138-1139.

Inhibitory Effect of Shensong Yangxin Capsule on the L-type Calcium Current and Potassium Current in the Rat Ventricular Myocytes

CHEN Lin-zhong1,CHENG Yu-rong2,LI Qing1△
(1.No.1 Clinical Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China; 2.The affilited Beijing Chanyang Hospital of Capital Medical University,Beijing 100020,China)

Objective:Explore the inhibitory effect of Shensong Yangxin capsule on rat ventricular myocyte L-type calcium current(Ica,L)and transient outward potassium current(Ito).Methods:Using enzymatic hydrolysis to separated rat ventricular muscle cells,using Shensong Yangxin solution(0.5 mg/100 ml,0.5%)perfusion ventricular muscle cells,using whole cell patch clamp technique to record the Ica,L and Ito,the cell membrane within 20 min after record all data,for each cell to do self-reflection,before and after observation and Shensong Yangxin solution of Ica,L and the impact of Ito channel current.Result:0.5% Shensong Yangxin solution has inhibitory effect on Ica,L and Ito,in particular,and Shensong Yangxin solution of Ito slow current component itqs has no obvious effect,but can obviously inhibitory the Ito Itof the rapid current components.Under-10 mV test voltage,after 0.5%role and Shensong Yangxin solution,Ica,L biggest activated peak current density from(8.64+2.43)pA/pF reduced to(5.92+2.15)pA/pF,the inhibitory rate of(31.85%+31.85%),current density and voltage(I-V)curves upward;Under 60 mV test voltage,after 0.5%of the role and shensong yangxin solution,Itof biggest activated peak current density from(23.53+3.31)pA/ pF is(16.86+2.34)pA/pF,the inhibitory rate of(28.33%+28.33%),the i-v curve down.And Shensong Yangxin solution without changing the Ica,L channel dynamics,but can make the Ito channel after the deactivation of slow recovery.Conclusion:Shensong Yangxin solution has obvious inhibitory effect on Ica,L and Ito.

Shensong Yangxin capsule;L-type calcium current;Transient outward potassium current;Inhibition

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0806-03

2015-01-11

程林忠(1964-),男,山西晉城人,副主任藥師,醫(yī)學本科,從事藥劑學的臨床與研究。

△通訊作者:李 青(1965-),男,山西塑州人,主任藥師,醫(yī)學博士,從事藥學的臨床與研究,Tel:18636680680,E-mail: liqing_1965@sohu.com。

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