包永欣，朱 虹，呂冠華，賈金玲，畢殿紅，石勝男，祝 寧，都 嵬，林一帆△

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院博士后科研工作站，沈陽 110015;2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽 110015; 3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院脾胃病科，沈陽 110031)

冬胃顆粒對(duì)寒邪客胃型胃潰瘍大鼠血清EGF、6-keto-PGF1a及ET-1的影響*

包永欣1，2，朱 虹2，呂冠華3，賈金玲3，畢殿紅3，石勝男3，祝 寧3，都 嵬3，林一帆2△

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院博士后科研工作站，沈陽 110015;2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽 110015; 3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院脾胃病科，沈陽 110031)

目的:探討冬胃顆粒對(duì)寒邪客胃型胃潰瘍大鼠血清細(xì)胞因子水平的影響。方法:采用乙酸注射法制備大鼠胃潰瘍模型，采用寒冷因素刺激復(fù)制寒邪客胃型動(dòng)物模型，前3 d先用0℃冰水浸泡，每次10 min，后3 d用0℃冰水灌胃，治療組同時(shí)給予藥物灌胃。觀察各組大鼠的癥狀、體征，測(cè)定大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)(UI)及潰瘍抑制率，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子含量。結(jié)果:冬胃顆粒組大鼠表現(xiàn)與大便性狀優(yōu)于西藥組。藥物治療可使?jié)兛s小，冬胃顆粒組優(yōu)于雷尼替丁組。與正常對(duì)照組比較，潰瘍模型及寒性潰瘍模型大鼠血清6-keto-PGF1α水平降低，ET-1水平增高;與寒性潰瘍組比較，治療組可明顯升高6-keto-PGF1α及EGF水平，降低ET-1水平，中藥治療組6-keto-PGF1α及EGF水平高于西藥治療組，ET-1水平低于西藥治療組。結(jié)論:寒性刺激可增加胃潰瘍大鼠胃黏膜損害，冬胃顆粒通過調(diào)整攻擊因子與保護(hù)因素平衡起到保護(hù)作用。

寒邪客胃;胃潰瘍;大鼠模型;冬胃顆粒

中醫(yī)認(rèn)為寒邪是重要的致病因素之一。寒冷刺激可使神經(jīng)系統(tǒng)興奮性升高，使胃黏膜血管收縮，引起缺血缺氧和抵抗力下降，從而引起潰瘍。［1］300現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胃潰瘍的發(fā)生主要是由于胃黏膜損害因素與保護(hù)因素間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)所致。本研究通過模擬寒邪客胃型胃潰瘍大鼠模型，觀察血清表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、前列環(huán)素(PGI2)及內(nèi)皮素(ET-1)的變化，并進(jìn)一步探討中藥冬胃顆粒的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，平均體質(zhì)量(200±20)g，由遼寧省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(質(zhì)量合格證編號(hào) SCXK〔遼〕2010-0001)。

1.1.2 藥物 冬胃顆粒由高良姜、香附、海螵蛸、黨參、炒白術(shù)、紅花、炙甘草組成，藥味比例3∶2∶4∶3∶3∶3∶2，10 g/袋，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院制劑室提供。生理鹽水按人與大鼠體表面積比例制成0.27 g/mL的溶液。

鹽酸雷尼替丁片由石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字H19994029)，0.15 g/片。用生理鹽水按人與大鼠體表面積比例制成2.7 g/mL的溶液。

1.1.3 儀器與試劑 6-酮前列腺素 F2a(6-keto-PGF2a)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及內(nèi)皮素-1(ET-1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒由方遠(yuǎn)達(dá)(北京)國(guó)際生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型 應(yīng)用冰乙酸漿膜下注射法制備大鼠胃潰瘍模型［2］，造模前禁食不禁水24 h，20%烏拉坦溶液4 ml·kg-1腹腔麻醉后，將大鼠仰臥位固定、開腹，在胃竇前壁胃壁肌層與漿膜層之間注入100%冰乙酸0.03 ml，然后覆蓋網(wǎng)膜，縫合腹膜、腹壁各層組織和皮膚。

1.2.2 分組及處置 50只大鼠分為5組，即正常對(duì)照組、潰瘍模型組、寒性潰瘍組、西藥治療組、中藥治療組。先按體質(zhì)量隨機(jī)分出10只作為正常組，其余4組造模2 d后再按體質(zhì)量隨機(jī)分組。寒性潰瘍組與治療組采用寒冷因素刺激，用0℃冰水浸泡大鼠10 min，水深2 cm共3 d。然后用0℃冰水1 ml/100 g大鼠灌胃，每日1次3 d，共6 d。中藥治療組及西藥治療組分別給予藥物溶液1ml/100 g灌胃，每日1次;正常對(duì)照組、潰瘍模型組應(yīng)用生理鹽水1 ml/100 g大鼠灌胃，前3 d每日1次，后3 d每日2次;寒性潰瘍組給予生理鹽水1 ml/100 g大鼠灌胃，每日1次，灌胃時(shí)間間隔4 h以上。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理 末次處置結(jié)束后，大鼠禁食不禁水24 h后麻醉，于腹主動(dòng)脈采血4 ml，在室溫下靜置2 h后離心(2500 r·min-1，10 min)，取血清分成3份，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法 ①潰瘍指數(shù)(UI)測(cè)定:采用游標(biāo)卡尺(精確度0.02 mm)測(cè)量潰瘍面的最大長(zhǎng)徑和垂直于最大長(zhǎng)徑的最大寬徑，以二者的乘積作為潰瘍指數(shù);②潰瘍抑制率按下述公式計(jì)算:潰瘍抑制率=(模型組平均潰瘍指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均潰瘍指數(shù))/模型組平均潰瘍指數(shù) × 100%;③血清EGF、6-keto-PGF1α及ET-1含量測(cè)定:采用ELISA法按試劑盒說明書步驟操作。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)之間比較應(yīng)用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)變化

正常組大鼠精神良好，進(jìn)食正常，被毛光澤，反應(yīng)靈活，大便正常，體質(zhì)量逐日遞增。潰瘍模型組大鼠造模后前2 d倦怠、懶動(dòng)、食少、體質(zhì)量明顯降低。2 d后進(jìn)食逐漸正常，反應(yīng)靈活，大便基本正常。寒性潰瘍組大鼠造模后前2 d倦怠、懶動(dòng)、食少、大便或干或軟、體質(zhì)量明顯降低。2 d后進(jìn)食稍增加，倦怠，蜷縮聚堆，毛發(fā)疏松粗糙，晦暗無光澤，大鼠稀溏，體質(zhì)量增加緩慢。治療組大鼠造模前2 d倦怠、懶動(dòng)、食少、大便或干或軟，體質(zhì)量明顯降低。2 d后進(jìn)食增加，反應(yīng)較寒性潰瘍組靈活，大便或干或溏，其中冬胃顆粒治療組大便性狀優(yōu)于西藥治療組。

2.2 潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較

表1 各組大鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較(±s)

表1 各組大鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較(±s)

注:與潰瘍模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與寒性潰瘍組比較:*P＜0.01;與西藥治療組比較:＊＊P＜0.05

組 別 大鼠(n)劑量(g/kg·d)潰瘍指數(shù)(mm2)潰瘍抑制率(%)潰瘍模型組 10 — 9.52±2.75—54.22寒性潰瘍組 10 — 10.72±2.97 —西藥治療組 10 27.00 7.10±2.02△＊ 45.40中藥治療組 10 2.70 4.78±2.09△△＊＊

2.3 血清6-keto-PGF1α、EGF、ET-1含量變化

表2 各組血清6-keto-PGF1α、EGF、ET-1含量變化比較(ug·L-1，±s)

注:與正常對(duì)照組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與潰瘍模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與寒性潰瘍組比較:□P＜0.05，□□P＜0.01;與西藥治療組比較:◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

組 別 大鼠(n) 劑量(g/kg.d) 6-keto-PGF1αEGF ET-1正常對(duì)照組 10 —31.69±10.29 2057.78±504.82 68.03±16.52潰瘍模型組 10 — 20.87± 7.33△△ 2145.06±585.95 117.31±31.27△△寒性潰瘍組 10 — 12.34± 5.11△△＊ 1922.28±401.03 126.91±26.99△△西藥治療組 10 27.00 22.36± 8.82△□ 2453.92±416.83□ 95.23±21.02△△＊□□中藥治療組 10 2.70 33.79±10.22＊＊□□◇◇ 2976.23±580.28△△＊＊□□◇ 73.60±18.82△△＊＊□□◇

3 討論

隨著人們生活水平的提高，空調(diào)和冰鎮(zhèn)食物的普及，寒邪致病也逐漸打破了季節(jié)和地域的限制。機(jī)體受到寒冷等應(yīng)激刺激后，交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性升高，血管收縮引起黏膜缺血缺氧，抵抗力下降，副交感神經(jīng)、垂體、腎上腺系統(tǒng)興奮性升高，引起胃酸、胃蛋白酶和胃泌素等攻擊因子增加，從而引起潰瘍［3］。內(nèi)皮素-1(ET-1)是從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離的一種活性多肽，含21個(gè)氨基酸殘基，具有強(qiáng)烈、持久的縮血管和促血管平滑肌增殖的作用。ET-1的這種縮血管作用，導(dǎo)致胃黏膜血流量下降，表現(xiàn)為很強(qiáng)的致潰瘍性［4］。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是參與黏膜修復(fù)的重要細(xì)胞因子，是細(xì)胞增殖和分化中起重要作用的分子［5］，具有抑制胃酸分泌、增加胃黏膜血流量、增加黏膜細(xì)胞的DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成、促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖的作用。而前列環(huán)素(PGI2)能通過抑制胃酸分泌、刺激組織修復(fù)過程、增加胃黏膜血流量，從而保護(hù)胃黏膜的完整性并加速潰瘍的愈合［6］。

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科根據(jù)北方地區(qū)人群易感受寒邪導(dǎo)致胃脘疼痛發(fā)生或加重，在古方良附丸的基礎(chǔ)上加味制成院內(nèi)制劑“冬胃顆?！?，治療寒性胃痛或急慢性胃炎、消化性潰瘍遇寒加重的患者，取得了較好的臨床療效［7］。方中高良姜為君，味辛大熱，溫胃祛寒，行氣止痛。《別錄》記載“主暴冷、胃中冷逆、霍亂腹痛”;香附為臣，行氣解郁，調(diào)經(jīng)止痛，主治肝胃不和，氣郁不舒;兩藥相配，一散寒凝，一行氣滯，共奏行氣散寒、溫中止痛之功;紅花辛溫，活血化瘀、祛瘀止痛;炒白術(shù)甘苦溫燥，燥濕健脾，健運(yùn)中州，培補(bǔ)后天之本，氣旺而陽亦復(fù)，共為臣藥;海螵蛸含有碳酸鈣，具有抗胃酸作用，制酸止痛，收斂止血，用為佐藥;甘草性溫補(bǔ)益脾氣、調(diào)和諸藥兼為佐使，全方配合共奏行氣散寒、祛瘀止痛、溫中健脾之功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，香附、高良姜皆有鎮(zhèn)痛作用，而高良姜更有抗?jié)?、抗炎、抗菌等作用。高良姜的抗炎?zhèn)痛作用可能與抑制前列腺素的合成釋放有關(guān)［8］。

為進(jìn)一步研究冬胃顆粒對(duì)寒性胃脘痛的保護(hù)作用機(jī)制，參照黎敬波等采用醋酸注射法造成大鼠胃潰瘍并施加寒性病因刺激，造成實(shí)寒證胃潰瘍大鼠模型方法［9］，對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠應(yīng)用寒冷刺激復(fù)制寒邪客胃型胃潰瘍大鼠模型，結(jié)果寒性潰瘍組大鼠比單純潰瘍組大鼠一般狀態(tài)差，體質(zhì)量增加緩慢。潰瘍組與寒性潰瘍組光鏡下病理提示，黏膜脫落形成明顯潰瘍，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜腺體消失，與機(jī)體表現(xiàn)相一致。寒性刺激可加重大鼠潰瘍黏膜損害，藥物治療可使?jié)兛s小，冬胃顆粒治療組優(yōu)于雷尼替丁組。與正常對(duì)照組比較，潰瘍模型及寒性潰瘍模型大鼠血清保護(hù)因子6-keto-PGF1α水平降低，損害因子ET-1水平增高;與寒性潰瘍組比較，治療組可明顯升高6-keto-PGF1α及EGF水平，降低ET-1水平，中藥治療組6-keto-PGF1α及EGF水平高于西藥治療組，ET-1水平低于西藥治療組。冬胃顆粒治療組能明顯提高血清6-keto-PGF1α含量，接近于正常對(duì)照組水平。潰瘍模型組與寒性潰瘍組EGF水平與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但中西藥治療組血清EGF含量與正常對(duì)照組、潰瘍模型組及寒性潰瘍組比較均有不同程度的升高。寒冷刺激雖然不能影響EGF水平，但通過溫中散寒止痛中藥冬胃顆粒的治療，其EGF水平卻明顯優(yōu)于西藥治療組。結(jié)果證明，寒性刺激可增加胃潰瘍大鼠胃黏膜損害，冬胃顆粒通過調(diào)整攻擊因子與保護(hù)因素平衡起到較好的保護(hù)作用。

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Effect of Dongwei Granule on Serum ET-1，6-keto-PGF1a and EGF in Gastric Ulcer Rats with Cold Pathogen

BAO Yong-xin1，ZHU Hong2，LV Guan-hua3，JIA Jin-ling3，BI Dian-hong3，SHI Sheng-nan3，ZHU Ning3，DU Wei3，LIN Yi-fan2△
(1.Post-Doctoral Research Center，the General Hospital of Shengyang Military Region，Shenyang 110016，China; 2.Department of TCM，the General Hospital of Shengyang Military Region，Shenyang 110016，China; 3.Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang 110034，China)

Objective:To study the influence of Dongwei Granule on the levels of cytokines in serum of Acetic Acidinduced Gastric Ulcer in Rats with cold stimulation.Methods:The rat model of gastric ulcer was constructed by injection of acetic acid.The rats were stimulated by cold，filled the stomach with 0℃ ice water 3 days after soaked with 0℃ ice water 3 days.The rats of treatment groups were filled the stomach with Chinese or western medicine.The changes of rat superficial signs and symptoms and ulcer sizes were recorded to calculate the ulcer index(UI)and ulcer inhibitory rate.And the levels of EGF，6-keto-PGF1αand ET-1 were detected by ELISA.Results:The signs and symptoms of treatment groups were better than ulcer model group.The treatment of Ranitidine and Dongwei granule can reduce the ulcer area of rat model.Compared with gastric ulcer model of cold stimulation group，the UI of treatment groups was reduced significantly.The ulcer inhibitory rate of Dongwei granule treatment group was better than Ranitidine treatment group.The levels of 6-keto-PGF1αof model of gastric ulcer group and gastric ulcer model of cold stimulation group were decreased significantly，and the levels of ET-1 were increased significantly compared with normal control group.The levels of 6-keto-PGF1αof gastric ulcer model of cold stimulation group were lower than model of gastric ulcer group.Compared with gastric ulcer model of cold stimulation group，the levels of 6-keto-PGF1αand EGF in serum of treating groups were increased significantly，the levels of ET-1 Were decreased significantly，the levels of 6-keto-PGF1αand EGF of Dongwei granule treatment group were higher than Ranitidine treatment group，and the levels of ET-1 were lower.Conclusion:Cold stimulation can aggravate the damage of gastric mucosa of gastric ulcer rats，and Dongwei granule can alleviate the damage through re-establishing the balance of attack factors and protective factors.

Cold Stimulation;gastric ulcer;rat model;Dongwei granule

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0809-03

2015-04-18

軍隊(duì)“十二五”中醫(yī)藥專項(xiàng)重點(diǎn)課題基金(10ZYZ102)-東北戰(zhàn)區(qū)軍人消化性潰瘍中醫(yī)證候分布規(guī)律與發(fā)病相關(guān)因素的調(diào)查及冬胃顆粒防治的研究

包永欣，女，在站博士后，從事中醫(yī)藥消化系統(tǒng)疾病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

△通訊作者:林一帆，E-mail:13309888130@163.com。