國立東，王麗群，蔣 琛，劉曉艷，于純淼，孟 丹

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

膽固醇是人體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，但血清膽固醇水平過高可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，進(jìn)而可能提高心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）發(fā)生的危險(xiǎn)性。世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）報(bào)道了全球30%人群的死亡源于CVDs，并預(yù)測未來20年CVDs將成為人類主要的死因[1]。自20世紀(jì)70年代MANN G V等[2]發(fā)現(xiàn)野生乳桿菌發(fā)酵乳具有降低人體膽固醇的作用以來，乳酸菌作為美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）評價(jià)食品添加劑的安全性指標(biāo)（generally recognizedas safe，GRAS）級食品微生物，其降膽固醇作用已通過大量體內(nèi)外試驗(yàn)得以證實(shí)，主要集中在屬于腸道正常菌群的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬兩個(gè)菌屬[3-5]。我國乳酸菌菌種資源豐富，已有眾多學(xué)者先后從我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離并篩選到性狀優(yōu)良的菌株，包括降膽固醇作用的功能乳酸菌菌種[6-8]。隨著研究的深入，乳酸菌降膽固醇作用的機(jī)理假說不斷被揭示，主要基于生長培養(yǎng)基、細(xì)胞模型、動(dòng)物模型而提出，同樣集中在乳桿菌屬和雙歧桿菌屬[9]，關(guān)于乳球菌屬菌株降膽固醇機(jī)制的探討并不多見。鑒于此，本試驗(yàn)對先前獲得的一株益生特性良好[10]，且能改善高膽固醇血癥小鼠血脂輪廓[11]的乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcuslactissubsp.lactis）HUCM 201菌株體外降膽固醇特性及其作用機(jī)制做進(jìn)一步研究，旨在為其作為降膽固醇益生菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）HUCM 201菌株：實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定并保存。?；悄懰徕c、?；敲撗跄懰徕c、甘氨膽酸鈉、甘氨脫氧膽酸鈉、甘氨鵝脫氧膽酸鈉：美國Sigma公司；溶菌酶：美國Amresco公司；其他試劑均為分析純。

改良MRS（mMRS）培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[12]介紹的方法配制：蛋白胨5 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，檸檬酸氫二銨2 g，K2HPO42 g，蒸餾水加至1 L，并用HCl調(diào)至pH 6.2，121 ℃濕熱滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DM2500顯微鏡：上海徠卡顯微鏡有限公司；PB-10pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；AE200分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；TGL-20bR離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SP-752紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；SPX-200-II生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BXM-30R全自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)與活化

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株采用mMRS培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)前至少用mMRS培養(yǎng)基活化3次。

1.3.2 體外去除膽固醇能力的檢測

將活化后的乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株按1%接種量接種于mMRS-THIO-OX-CHOL液體培養(yǎng)基（mMRS培養(yǎng)基分別補(bǔ)加0.2%巰基乙酸鈉、0.3%牛膽汁和100μg/mL膽固醇）中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液經(jīng)12000×g（4 ℃）離心10 min得上清液。采用鄰苯二甲醛法[13]分別檢測上清液及接種前培養(yǎng)基中的膽固醇含量。菌株對膽固醇去除率按下列公式計(jì)算：

1.3.3 體外去除膽固醇的機(jī)制研究

活化的菌株按1%接種量接種至mMRS-THIO-OXCHOL液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，12 000×g（4 ℃）離心10 min得“上清液”。隨后，將離心得到的菌泥用MRSTHIO-OX液體培養(yǎng)基連續(xù)洗滌3次并收集上清液，合并3次所得上清液，并補(bǔ)加MRS-THIO-OX液體培養(yǎng)基至初始培養(yǎng)液相同體積，即為“洗滌液”。同時(shí)，將菌體細(xì)胞用mMRS-THIO-OX液體培養(yǎng)基懸浮，加溶菌酶至終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，37 ℃水浴30 min，立即冰浴下超聲波破碎細(xì)胞，同樣補(bǔ)加MRS-THIO-OX液體培養(yǎng)基至初始體積，12 000×g（4 ℃）離心10 min取上清得“細(xì)胞裂解液”。同樣采用鄰苯二甲醛法分別對初始膽固醇對照、菌株培養(yǎng)液的離心上清液、洗滌液以及細(xì)胞裂解液中膽固醇含量進(jìn)行測定，檢測膽固醇在各個(gè)部分的分布情況。菌株對膽固醇的降解率按下列公式計(jì)算：

1.3.4 膽鹽水解酶活力測定

乳酸菌的膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活性是通過檢測其從結(jié)合型膽酸鹽釋放出游離氨基酸（?；撬峄蚋拾彼幔┑牧窟M(jìn)行評價(jià)。活化的菌株HUCM 201按1%接種量接種于mMRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)20 h后，發(fā)酵液經(jīng)12 000×g（4 ℃）離心10 min得菌泥，并經(jīng)冰浴條件下超聲波破碎細(xì)胞，以提取粗酶液，分別與5種不同結(jié)合型膽酸鹽共培養(yǎng)后，采用茚三酮試劑對釋放出的牛磺酸或甘氨酸進(jìn)行檢測，具體步驟參見文獻(xiàn)[14]。分別以?；撬岷透拾彼釣闃?biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定菌株的BSH活性。BSH活力單位定義為每分鐘粗酶液從底物釋放?；撬峄蚋拾彼岬拿噶繛橐粋€(gè)酶活單位，U/mL。比酶活定義為每1 mg蛋白質(zhì)所含BSH的活力單位數(shù)，U/mg。

1.3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

采用Bradford法[15]測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0用于試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HUCM 201的降膽固醇作用

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株培養(yǎng)于含膽固醇的培養(yǎng)基后，對培養(yǎng)基中膽固醇的去除能力見表1。

表1 乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株的體外膽固醇去除能力Table 1 In vitro cholesterol removal ability of L.lactis subsp. lactis HUCM 201

從表1結(jié)果可知，菌株HUCM 201接種于mMRS-THIOOX-CHOL液體培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后，能將培養(yǎng)基中膽固醇質(zhì)量濃度從101.2 μg/mL降至67.7 μg/mL，去除了培養(yǎng)基中33.1%的膽固醇，其膽固醇去除率略高于L.lactissubsp.lactisbiovardiacetylactisATCC 13675（31.0%）[16]。

2.2 菌株HUCM 201體外去除膽固醇的機(jī)制

圖1 不同部分的膽固醇質(zhì)量濃度Fig.1 The cholesterol concentrations in different fractions

含有膽固醇的培養(yǎng)基經(jīng)菌株HUCM 201發(fā)酵后，培養(yǎng)基中膽固醇的去向可能有4個(gè)方面：（1）發(fā)酵液離心上清液中殘留的膽固醇；（2）菌泥洗滌液中的膽固醇；（3）細(xì)胞內(nèi)的膽固醇；（4）菌株降解的膽固醇。菌泥洗滌液中含有的膽固醇是由于乳酸菌具有BSH活性，其能將膽汁中的結(jié)合型膽酸鹽降解成游離的膽酸鹽，新生成的游離膽酸鹽能與膽固醇在低pH值條件下形成沉淀即共沉淀作用機(jī)理，經(jīng)pH 6.0的mMRS-THIO-OX液體培養(yǎng)基洗滌后能重新得以溶解[17]。細(xì)胞裂解液中含有的膽固醇是由于乳酸菌細(xì)胞能夠吸收周圍環(huán)境中的膽固醇[18]。將最終沒有復(fù)得的膽固醇?xì)w于乳酸菌對膽固醇的降解作用，通過對菌株發(fā)酵液處理得到的上清液、洗滌液、細(xì)胞裂解液以及初始膽固醇含量的檢測，便可知菌株HUCM 201是通過何種機(jī)制將培養(yǎng)基中膽固醇去除的，結(jié)果見圖1。

從圖1可知，菌株HUCM 201發(fā)酵mMRS-THIO-OXCHOL液體培養(yǎng)基后，上清液中膽固醇占（66.9±1.3）%，洗滌液中膽固醇占（14.3±1.0）%，細(xì)胞裂解液中膽固醇占（18.1±1.3）%。菌株對膽固醇的降解率為0.7%，由此可認(rèn)為菌株并不能降解膽固醇。由此判定，菌株HUCM 201對培養(yǎng)基中膽固醇的去除，主要?dú)w因于其菌體細(xì)胞對膽固醇的吸收作用和BSH活性引起的共沉淀作用兩個(gè)方面，這與GRILL J P等[18]的研究結(jié)果一致，但乳酸菌吸收膽固醇到細(xì)胞內(nèi)，并未將其降解，其生物學(xué)意義仍有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.3 菌株HUCM 201的BSH活性

乳酸菌的BSH活性具有底物特異性，為了進(jìn)一步驗(yàn)證HUCM 201菌株BSH活性的主要作用底物，分別以5種常見結(jié)合型膽酸鹽為檢測底物，對菌株HUCM 201的BSH活性進(jìn)一步加以確定，從而深入揭示其降膽固醇的機(jī)制。乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株的BSH活性檢測結(jié)果見表2，分別用總酶活（U/mL）和比酶活（U/mg）表示酶活性。

表2 乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株的BSH活性Table 2 The BSH activity of L.lactis subsp. lactis HUCM 201 strain

從表2結(jié)果可知，菌株HUCM 201對5種結(jié)合型膽酸鹽表現(xiàn)出了不同的BSH活性，具有底物特異性。其中，對甘氨膽酸鈉展現(xiàn)出了最高的BSH活性，總酶活為0.279 U/mL，比酶活為0.076 U/mg；對甘氨鵝脫氧膽酸鈉的BSH活性最低，總酶活為0.049 U/mL，比酶活為0.013 U/mg；對牛磺膽酸鈉和?；敲撗跄懰徕c的BSH活性居中。乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201對甘氨膽酸鈉的水解強(qiáng)度是甘氨脫氧膽酸鈉的4.9倍，是甘氨鵝脫氧膽酸鈉的5.7倍，是?；悄懰徕c的3.2倍，是?；敲撗跄懰徕c的3.4倍。由此推測，菌株HUCM 201共沉淀部分的膽固醇主要?dú)w因于其對甘氨膽酸鈉的水解作用。

3 結(jié)論

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株可從培養(yǎng)基中去除33.1%的膽固醇，體外去除膽固醇的機(jī)制主要?dú)w于其對膽固醇的吸收作用和其BSH活性而引起的共沉淀理論兩個(gè)方面，并未發(fā)現(xiàn)其對膽固醇的降解作用，此外發(fā)現(xiàn)其對甘氨膽酸鈉的水解活性最高，在共沉淀的發(fā)生中起主要作用。

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