徐超，張軍毅，朱冰川，宋挺，黃君，吳蔚

(無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站， 江蘇 無錫 214121)

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夏季太湖梅梁灣水體中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)

徐超，張軍毅*，朱冰川，宋挺，黃君，吳蔚

(無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站， 江蘇 無錫 214121)

利用高通量測序技術(shù)，選擇16S rRNA V6區(qū)作為目標(biāo)片段，對夏季太湖梅梁灣水體中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，共產(chǎn)生了101 427條優(yōu)質(zhì)序列，細(xì)菌為100 935條，占99.5%；在藍(lán)藻暴發(fā)期間，共檢測到14門，55屬，610個(gè)操作分類單位。優(yōu)勢門類為藍(lán)藻門(39.7%)，放線菌門(27.2%)和變形菌門(23.4%)，微囊藻屬(21.0%)和聚球藻屬(15.9%)為主要優(yōu)勢種。

高通量測序；群落結(jié)構(gòu)；16S rRNA；太湖

2007年無錫市發(fā)生“供水危機(jī)”之后，太湖不但成為國際關(guān)注的焦點(diǎn)，更是成為大型淺水富營養(yǎng)化湖泊研究的典范[1-12]。近年來，藍(lán)藻水華的持續(xù)暴發(fā)和最大聚集面積有冬季后移的傾向，表明藍(lán)藻水華監(jiān)測及其治理的復(fù)雜性和艱巨性。

細(xì)菌在微食物網(wǎng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)起著關(guān)鍵性作用，在全球性水體富營養(yǎng)化進(jìn)程中，隨著攝食食物鏈的變細(xì)與變短，以及微生物環(huán)的持續(xù)增粗，細(xì)菌在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用顯著增加。目前基于營養(yǎng)鹽、氣象等研究藍(lán)藻水華暴發(fā)的很多[2,13-17]，而基于細(xì)菌來探索藍(lán)藻水華暴發(fā)機(jī)制的并不是很多[18-19]。

現(xiàn)利用高通量測序技術(shù)，研究藍(lán)藻水華暴發(fā)期間的細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，以期為后續(xù)研究藍(lán)藻水華和細(xì)菌的相互關(guān)系、以及探索藍(lán)藻水華的暴發(fā)機(jī)制提供參考。

1 研究方法

1.1 樣本采集及其V6區(qū)擴(kuò)增

樣品采自2013年8月23日太湖梅梁灣，取2 L表層水樣，用0.22 μm微孔濾膜富集，后立即-20 ℃冷凍?；貙?shí)驗(yàn)室后即進(jìn)行DNA提取，采用E.Z.N.A.? Water DNA Kit(OMEGA,USA)。用Nano Drop ND 1000(Thermo Scientific,DE,USA)進(jìn)行定量分析。V6 目標(biāo)區(qū)的擴(kuò)增，共27個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如下。預(yù)變性：94 ℃,5 min，變性：94 ℃,30 s，退火：50 ℃,30 s，延伸：72 ℃,30 s,最后72 ℃,5 min。為了避免引物擴(kuò)增的偏向性，采用針對細(xì)菌16S rRNA的融合引物。上游引物：967F-PP 5′-CNACGCGAAGAACCTTANC-4′,967F-UC1 5′-CAACGCGAAAAACCTTACC-4′,967F-UC2 5′-CAACGCGCAGAACCTTACC-4′,967F-UC4 5′-ATACGCGARGAACCTTACC-4′,967F-AQ 5′-CTAACCGANGAACCTYACC-4′。下游引物：1046R 5′-CGACAGCCATGCANCACCT-4′,1046R-PP 5′-CGACAACCATGCANCACCT-4′,1046R-AQ1 5′-CGACGGCCATGCANCACCT-4′。

1.2 測序及其數(shù)據(jù)處理

采用Illumina MIseq PE250測序平臺。數(shù)據(jù)分析可以包含以下流程。首先，初步質(zhì)量過濾：步長為 1 的5 bp窗口從第一個(gè)堿基位置開始移動，窗口中堿基平均質(zhì)量>Q20，從第一個(gè)150；然后，用軟件 Flash連接通過質(zhì)量過濾的序列。然后，對連接上的序列通過 index 完全匹配得到每個(gè)樣品的有效序列。其次，去除嵌合體得到優(yōu)質(zhì)序列：通過mothur軟件中 uchime的方法去除嵌合體序列。并通過Qiime以下規(guī)則進(jìn)行第二次過濾：5′端前引物檢查，允許最大錯(cuò)配數(shù)1去；除模糊堿基數(shù)>0、單堿基高重復(fù)區(qū)>8 bp以及長度<200 bp 的序列[20]。最后，OTU列表生成及注釋，及其過濾后的有效序列：在 Qiime 中調(diào)用 uclust的方法對優(yōu)質(zhì)序列按相似度0.97進(jìn)行聚類，選取每個(gè)類最長的序列為代表序列。然后再在Qiime中調(diào)用 RDP-classifie的方法，以GG 數(shù)據(jù)庫(13.5)的序列為訓(xùn)練集，對 OTU 代表序列進(jìn)行注釋；采用 blast的方法對序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得每個(gè) OTU 分類學(xué)信息。將原始 OTU按照0.005%的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精簡以去除可信度較低的序列[21-22]，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步分析。

2 結(jié)果討論

2.1 測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Illumina Miseq PE250測數(shù)的數(shù)據(jù)概要見表1。

表1 測序數(shù)據(jù)概要①

①有效序列為雙端有效拼接后序列；優(yōu)質(zhì)序列為去除嵌合體序列；過濾序列為執(zhí)行0.005%的過濾標(biāo)準(zhǔn)后過濾序列

由表1可見，通過有效拼接、去嵌合體和過濾，可以獲得101 427條，平均長度為79的序列(去除了引物)。執(zhí)行0.005%的過濾標(biāo)準(zhǔn)，去掉<6以下的序列后，共總?cè)サ袅?8 214條序列，去除濾為15.2%。注解結(jié)果中，并未發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌，表明融合引物的特異性較好。僅發(fā)現(xiàn)了492條沒有比對上的序列，所占比列為0.5%，可見V6區(qū)對太湖夏季水體的細(xì)菌群落具有較好的識別力。

2.2 細(xì)菌群落特征

V6區(qū)對于細(xì)菌物種的鑒定在門、綱、目、科、屬、種等6個(gè)分類水平上表現(xiàn)出差異。在門水平上100 935條序列，100.0%可以注解，但到了屬水平上，僅有43.5%序列可以注解。物種鑒定的效率是隨著分類水平下降呈明顯下降趨勢，見表2。

表2 各分類水平上的OTUs、個(gè)數(shù)和序列數(shù)

由表2可見，獲得了100 935條過濾后的優(yōu)質(zhì)細(xì)菌序列，隸屬于藍(lán)藻門,39.7%；放線菌門,27.3%；變形菌門,23.4%；疣微菌門Verrucomicrobia,2.5%；綠菌門Chlorobi,2.2%；擬桿菌門Bacteroidetes,2.1%；綠彎菌門Chloroflexi,1.1%；浮霉菌Planctomycetes,0.6%；酸桿菌門Acidobacteria,0.5%；芽單胞菌門Gemmatimonadetes,0.4%；厚壁菌門Firmicutes,0.3%；軟壁菌門Tenericutes,0.01%；GN02,0.01%；裝甲菌門Armatimonadetes,0.01%等14門。其中，優(yōu)勢門類為藍(lán)藻門，放線菌門和變形菌門，合計(jì)90.4%。藍(lán)藻門在豐度方面占具明顯優(yōu)勢，這主要體現(xiàn)在水體中的微囊藻Microcystis spp.(21.0%)。通過對同步浮游植物樣本的顯微鏡觀察分析，微囊藻的優(yōu)勢度高達(dá)95.4%。

14門共鑒定了610個(gè)OTUs。隸屬于變形菌門，42.5%；藍(lán)藻門，16.6%；放線菌門，15.2%；擬桿菌門，9.5%；疣微菌門，4.8%；浮霉菌，3.6%；綠菌門，2.0%；酸桿菌門，2.0%；綠彎菌門，1.1%；芽單胞菌門，1.1%；厚壁菌門，1.1%；軟壁菌門，0.2%；GN02，0.2%；裝甲菌門，0.2%等14門。其中，優(yōu)勢門類為藍(lán)藻門，放線菌門和變形菌門，合計(jì)74.3%。

在屬水平上，共鑒定55屬，183個(gè)分類單元。其中值得關(guān)注的是微囊藻屬21 162條序列，12個(gè)OTUs和聚球藻屬16 053條序列，22個(gè)OTUs。微囊藻屬和聚球藻屬序列分別占屬水平的21.0%，15.9%， OTUs分別占6.6%，28.4%。

文獻(xiàn)[23]通過DGGE的手段對中國富營養(yǎng)化湖泊，太湖和巢湖的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究表明，在富營養(yǎng)化水平較高的地方，微囊藻占優(yōu)勢種，而在一些藻類生物量較低的地方聚球藻占優(yōu)勢種。除此之外，太湖水體藍(lán)藻門還發(fā)現(xiàn)有擬浮絲藻屬Planktothricoides、束絲藻屬Aphanizomenon、細(xì)鞘絲藻屬Leptolyngbya、長胞藻屬Dolichospermum、顫藻屬Oscillatoria和假魚腥藻屬Pseudanabaena等6個(gè)常見種類，與光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果一致，見表3。

表3 屬水平上的種類明細(xì)①

續(xù)表

①*為藍(lán)藻門；A為高豐度(reads數(shù)>10 000) ；B為中豐度(100

3 結(jié)論

太湖藍(lán)藻水華暴發(fā)期間，共檢測到14門，55屬，610個(gè)OTUs。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征較為明顯，主要優(yōu)勢門類為藍(lán)藻門(39.7%)，放線菌門(27.2%)和變形菌門(23.4%)，3門共計(jì)90.4%。在屬水平上，微囊藻屬(21.0%)和聚球藻屬(15.9%)為主要優(yōu)勢種。此外，假魚腥藻在微囊藻膠被中大量存在的現(xiàn)象也被證實(shí)。

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《環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警》編輯部

Extensive Profiling of a Bacterial Community during Summer in Meiliang Bay,Lake Taihu

XU Chao,ZHANG Jun-yi*,ZHU Bing-chuan,SONG Ting,HUANG Jun,WU Wei

(WuxiEnvironmentalMonitoringCentralStation,Wuxi,Jiangsu214121,China)

In order to explore the prokaryotic community during summer in Meiliang Bay,Lake Taihu, we performed high-throughput sequencing of the 16S rRNA genes V6 hypervariable regions. The results showed that a total of 101 427 quality reads (bacterial reads 100 935, 99.5%) were obtained.Bacteria were found belonging to 14 phyla, 55 genera, and 610 OTUs. At the phylum level, the bacterial community composition was predominated byCyanobacteria(39.7%),Actinobacteria(27.2%),Proteobacteria(23.4%). At the genus level,Microcystis(21.0%) andSynechococcus(15.9 %) was the most abundant genus.

High-throughput sequencing; Community structure; 16S rRNA; Lake Taihu

2014-10-11；

2014-12-23

江蘇省環(huán)境監(jiān)測科研基金資助項(xiàng)目(1320)。

徐超(1986—)，女，助理工程師，碩士，主要從事水域生態(tài)學(xué)研究。

*通訊作者：張軍毅 E-mail：blocksharon@163.com

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1674-6732(2015)01-0037-04