郭楊，馬勇，△，成吉華，趙丹，沈李李，王培民

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，南京210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京210029)

益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖和成骨分化的影響?

郭楊1，馬勇1，2△，成吉華1，趙丹1，沈李李1，王培民2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，南京210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京210029)

目的:觀察益腎通絡(luò)含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影響。方法:分離BMSCs分為對(duì)照組(A組)、低濃度組(B組)、中濃度組(C組)、高濃度組(D組)、陽性對(duì)照組(E組)，干預(yù)后檢測(cè)細(xì)胞增殖和成骨分化情況。結(jié)果: CCK-8:干預(yù)24 h、72 h后B、C、D組均高于A組，干預(yù)120 h后B組高于A、C、D組。ALP活性干預(yù)7、14 d后B、C、D組高于A組，但低于E組。結(jié)論:益腎通絡(luò)含藥血清能促進(jìn)BMSCs體外增殖并誘導(dǎo)其成骨分化。

益腎通絡(luò);骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞增殖;成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)由于其具有自我更新能力且易分離、多向分化潛能等特性，為修復(fù)各種類型的骨缺損及治療股骨頭壞死開拓了寬闊的前景，成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來有研究表明［1］，中醫(yī)藥可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化。本實(shí)驗(yàn)采用以益腎通絡(luò)為主的中藥復(fù)方，探尋其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響，以進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

健康2周齡純種新西蘭大白兔1只，體質(zhì)量186 g;健康3月齡純種新西蘭大白兔4只，體質(zhì)量2.5 kg，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(蘇)2012-008)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

益腎通絡(luò)復(fù)方:鹿角膠20 g，骨碎補(bǔ)20 g，三七粉15 g，水蛭15 g，土鱉蟲15 g，黃芪15 g，當(dāng)歸15 g，枸杞子15 g，地龍12 g，雞血藤12 g，杜仲12 g，白術(shù)10 g，白芍10 g，桑寄生10 g，淫羊藿10 g，甘草5 g，共16味中藥(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供);Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);堿性磷酸酶活性測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要器材與儀器

倒置式系統(tǒng)相差顯微鏡(日本Olympus); ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek);低速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus);JY88-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清的制備

取健康3月齡純種新西蘭大白兔4只，體質(zhì)量2.5 kg，按隨機(jī)數(shù)字表法分為灌胃組和對(duì)照組每組各2只，灌胃組按7.2 g/kg·d給藥益腎通絡(luò)復(fù)方濃縮液(相當(dāng)于含生藥量1 g/ml)，對(duì)照組按7.2 g/kg· d劑量灌服生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d，于最后1次灌胃后1 h行麻醉下頸動(dòng)脈取血，4℃靜置過夜后3000 r/min離心20 min，分離上層血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm針頭式過濾器過濾血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

2.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)取健康2周齡純種新西蘭大白兔1只，空氣栓塞處死，無菌條件下剝離出股骨、脛骨，剪斷兩端骨骺，用20 ml注射器吸取PBS溶液反復(fù)沖洗骨髓腔和干骺端，直至骨髓腔變白，收集沖洗溶液至離心管內(nèi)，1200 r/min離心5 min棄上清液，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基吹打重懸，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，7 d后換液。棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d換1次液，待細(xì)胞鋪滿皿底80%～90%時(shí)，按照1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2.2 傳代細(xì)胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)步驟:待細(xì)胞生長(zhǎng)增殖并鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí)，棄原培養(yǎng)基加入PBS沖洗2次，加入胰酶-EDTA消化液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變圓，呈懸浮游離狀，立即加入10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min棄上清液，加入培養(yǎng)基吹打重懸，分別接種于3個(gè)培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

選用第3代BMSCs細(xì)胞，以1×104/ml細(xì)胞密度、100 μL/孔接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(A組)、低濃度組(B組)、中濃度組(C組)和高濃度組(D組)，每組5個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組加入含10%對(duì)照血清培養(yǎng)基，低、中、高濃度組分別加入5%、10%、15%含藥血清培養(yǎng)基，參照CCK-8試劑說明書，于干預(yù)24 h、72 h、120 h進(jìn)行細(xì)胞增殖活性檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD值)。

2.4 堿性磷酸酶活性檢測(cè)

選用第三代BMSCs細(xì)胞，以5×104/ml細(xì)胞密度，1 ml/孔接種于2塊24孔培養(yǎng)板，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(A組)、低濃度組(B組)、中濃度組(C組)、高濃度組(D組)、陽性對(duì)照組(E組)，每組4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組加入含10%對(duì)照血清培養(yǎng)基，低、中、高濃度組分別加入5%、10%、15%含藥血清培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加入成骨誘導(dǎo)液(含10%空白兔血清、10-8mmol/L地塞米松﹑10 mmol/L β-甘油磷酸鈉﹑50 mg/L維生素C的培養(yǎng)基)，于干預(yù)第7、14天棄培養(yǎng)基，用胰酶-EDTA消化后，超聲破碎細(xì)胞(冰水浴，每3～5 s超聲1次，間隔4次)，參照說明書進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，不滿足方差分析條件時(shí)釆用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原代和傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)7 d見散在少量貼壁細(xì)胞，呈梭形、多角形或不規(guī)則狀，周圍有大量雜質(zhì)圓形細(xì)胞(圖1-A);傳代1次培養(yǎng)后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈梭形、多角形，雜質(zhì)細(xì)胞明顯減少(圖1-B);第2次傳代后細(xì)胞增殖快，呈多角形或不規(guī)則狀，培養(yǎng)5 d即可鋪滿皿底(圖1-C);至第3代BMSCs細(xì)胞外觀呈長(zhǎng)梭形，呈緊密排列，符合BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)特征(圖1-D)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代和傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

3.2CCK-8細(xì)胞增殖結(jié)果

表1顯示，干預(yù)24 h后各濃度含藥血清組OD值大于空白對(duì)照組(P=0.011，0.000，0.000＜0.05)，其中中濃度和高濃度組OD值高于低濃度組(P=0.002，0.000＜0.01);干預(yù)72 h后，各濃度含藥血清組OD值均大于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，0.000，0.001＜0.01)，各濃度組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);干預(yù)120 h后，低濃度組高于空白對(duì)照組、中濃度和高濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，0.004，0.000＜0.01)。

3.3 堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果

表2顯示，干預(yù)7、14 d后，各濃度組和陽性對(duì)照組堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000＜ 0.01)，各濃度組之間ALP活性隨著濃度升高而增大(P=0.000＜0.01)，陽性對(duì)照組ALP活性高于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000＜0.01)。

表1 CCK-8比色法檢測(cè)益腎通絡(luò)含藥血清對(duì)BMSCs增殖的影響(±s)

表1 CCK-8比色法檢測(cè)益腎通絡(luò)含藥血清對(duì)BMSCs增殖的影響(±s)

注:與對(duì)照組比較:△P＜0.01，△△P＜0.05;與低濃度組比較:▲P＜0.01

組別例數(shù)OD 值24 h72 h120 h空白對(duì)照組(A組)52.6176±0.03912.9554±0.04403.0748±0.1333低濃度組(B組)52.7046±0.0279△△3.1070±0.0537△3.3260±0.0639△中濃度組(C組)52.8140±0.0589△▲3.1142±0.0288△3.1266±0.0582▲高濃度組(D組)52.8868±0.5741△▲3.0616±0.0433△2.9930±0.0966▲

表2 益腎通絡(luò)含藥血清對(duì)BMSCs堿性磷酸酶活性的影響(±s)

表2 益腎通絡(luò)含藥血清對(duì)BMSCs堿性磷酸酶活性的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:△P＜0.01;與陽性對(duì)照組比較:▲P＜0.01

組別例數(shù)堿性磷酸酶(U/gprot) 7 d14 d空白對(duì)照組(A)40.4380±0.02390.3387±0.0035低濃度組(B)40.9377±0.0350△0.6341±0.0217△中濃度組(C)41.0462±0.0533△0.8729±0.0452△高濃度組(D)41.2368±0.0114△1.0098±0.0346△陽性對(duì)照組(E)41.5002±0.0434△▲1.2986±0.0482△▲

4 討論

CCK-8法是利用水溶性四唑鹽WST-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臢染料，能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臢量與活細(xì)胞數(shù)量呈正比，被認(rèn)為是正確評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況的一種客觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)24 h、72 h后各濃度含藥血清組比較，空白對(duì)照組均能促進(jìn)BMSCs的增殖，24 h低濃度含藥血清的增殖效應(yīng)低于中、高濃度組，但隨著時(shí)間增加，低濃度含藥血清增殖效應(yīng)高于空白對(duì)照組、中濃度和高濃度組，說明低濃度含藥血清具有穩(wěn)定促進(jìn)BMSCs體外增殖的作用。

ALP作為成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，在基質(zhì)合成期開始出現(xiàn)，鈣化期達(dá)到高峰［2］，是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志性酶之一，能夠反映成骨細(xì)胞合成I型膠原、形成骨基質(zhì)的能力［3］，故其可作為成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)來衡量MSCs成骨分化的程度［4］。本實(shí)驗(yàn)選用其作為觀察益腎通絡(luò)復(fù)方促BMSCs成骨分化的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，結(jié)果證實(shí)，益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清具有成骨誘導(dǎo)作用，其效應(yīng)隨著含藥血清濃度而增加，但其效應(yīng)弱于成骨誘導(dǎo)液，表明益腎通絡(luò)含藥血清能在一定程度上促進(jìn)BMSCs體外成骨分化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有成骨分化的特性，這與中醫(yī)“腎藏精，精生髓，髓生骨”的理論相吻合，因?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞來自于骨髓，而在特定條件下能向成骨轉(zhuǎn)化，即實(shí)現(xiàn)“髓生骨”，因此BMSCs屬于中醫(yī)學(xué)“髓”的范疇。本實(shí)驗(yàn)采用的益腎通絡(luò)方是江蘇省中醫(yī)院許建安教授治療股骨頭壞死的臨床驗(yàn)方［5］。本方重用鹿角膠、骨碎補(bǔ)溫補(bǔ)腎陽，三七粉、水蛭、土鱉蟲、地龍活血通絡(luò)，黃芪、白術(shù)、當(dāng)歸、枸杞子、雞血藤補(bǔ)氣血、調(diào)經(jīng)絡(luò)，杜仲、桑寄生、淫羊藿補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨，白芍、甘草緩急止痛。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，10%菟絲子含藥血清有促進(jìn)MSCs增殖的作用，可能與其促進(jìn)BMP-2 mRNA表達(dá)有關(guān)［6］。徐凌霄等［7］研究表明，大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)左歸丸含藥血清誘導(dǎo)后可以分化為成骨細(xì)胞，能夠促使誘導(dǎo)過程中堿性磷酸酶含量表達(dá)增加。閆寶勇等［8］研究表明，補(bǔ)腎壯骨中藥可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌OPG、RANKL的功能，從而降低破骨細(xì)胞的活力，促進(jìn)成骨過程。

從上述結(jié)果可以看出，益腎通絡(luò)復(fù)方可能是以BMSCs為作用靶點(diǎn)，通過促進(jìn)其增殖和成骨分化，增加成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，促進(jìn)骨形成，從而達(dá)到防治股骨頭壞死的作用，這也為從干細(xì)胞角度研究中藥防治股骨頭壞死的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］楊鋒，唐德志，卞琴，等.中藥誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011(10):1847-1850.

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Effect of Yishen Tongluo Prescription Containing Serum on the Osteogenic Differentiation of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro

GUO Yang1，MA Yong1，2△，CHENG Ji-hua1，ZHAO Dan1，SHEN Li-li1，WANG Pei-min2
(1．Institute of Traumatology＆Orthopedics，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2．Department of Traumatology＆Orthopedics，Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

Objective:To observe the effect of serum containing Yishen Tongluo decoction on proliferation and osteogenic differentiation of the bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in vitro.Methods:To isolate and culture the BMSCs in vitro.The cells were randomly divided into blank control group(A group)，low-concentration group(B group)，medium-concentration group(C group)，high-concentration group(D group)，and positive control group(E group).Observing the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs.Results:CCK-8:Intervention after 24 h，72 h，OD value of B，C，D group were greater than A group;Intervention after 120 h，OD value of B group greater than A，C，D group.ALP activity results:intervention after 7d，14 d，B，C，D group were higher than A group，but lower than E group.Conclusion:Serum containing Yishen Tongluo decoction can promote the proliferation of BMSCs in vitro and induce the osteogenetic differentiation at the same time.

Yishen Tongluo;Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs);Cell Proliferation;Osteogenic differentiation

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0508-03

2015-02-09

江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目(2011-WS039D)-益腎通絡(luò)法干預(yù)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療激素性股骨頭缺血性壞死的研究;江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(LZ09039)-中藥干預(yù)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療激素性股骨頭缺血性壞死的實(shí)驗(yàn)研究;南京中醫(yī)藥大學(xué)2013年大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目-益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及成骨活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

郭楊(1985-)，男，江蘇宿廷人，教師，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治骨關(guān)節(jié)病的臨床與研究。

△通訊作者:馬勇(1963-)，男，江蘇揚(yáng)中人，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療骨關(guān)節(jié)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，Tel:15061529758，E-mail:cjhtcm@126.com。