王安平，朱善元，王永娟，吳 雙，左偉勇，洪偉鳴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州225300)

鴨甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus，DHAV)屬于小RNA病毒科禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，臨床上主要引起21日齡以下的雛鴨發(fā)生急性肝炎，病死率高達(dá)100%，是一種急性高度致死性傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疫病之一［1-2］。DHAV包括經(jīng)典型(即中國(guó)原Ⅰ型鴨肝炎病毒)、臺(tái)灣新型、韓國(guó)新型3種亞型，名稱(chēng)分別為DHAV-1，DHAV-2 和 DHAV-3［3-5］，3 個(gè)型之間存在明顯的差異，無(wú)交叉抗原性，其中DHAV-1呈世界性分布，也是中國(guó) DHAV流行的主要血清型［6-7］。DHAV呈二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑為20～40 nm，無(wú)囊膜，核心為單股正鏈RNA，整個(gè)基因組約有7 690個(gè)核苷酸組成，不含5’帽子結(jié)構(gòu)，3’端有poly(A)尾巴，只有一個(gè)較大的開(kāi)放讀碼框，病毒的RNA指導(dǎo)合成一條完整蛋白，稱(chēng)為多聚蛋白。多聚蛋白在翻譯過(guò)程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，分解成小片段蛋白，分別為結(jié)構(gòu)蛋白(VP0，VP3，VP1)和非結(jié)構(gòu)蛋白(2A1，2A2，2A3，2B，2C，3A，3B，3C，3D)［8-9］。與其他小 RNA 病毒不同，DHAV VP0末端缺少GxxxS/T基序，因此其N(xiāo)端可能未被十二烷基化，VP0不能被切割為VP2和VP4［2］。目前，關(guān)于DHAV結(jié)構(gòu)蛋白的研究多集中于抗原優(yōu)勢(shì)蛋白VP1和VP3，對(duì)于VP0的研究相對(duì)較少。VP0結(jié)構(gòu)蛋白主要位于病毒粒子的表面，具有較強(qiáng)的抗原性和宿主保護(hù)位點(diǎn)，而且與VP1和VP3不同的是，VP0在不同毒株間相對(duì)保守［9］。因此，本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)DHAV-1 SH株的VP0基因，制備其多抗血清，為DHAV-1的基礎(chǔ)研究和檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和載體

DHAV-1 SH毒株由中國(guó)上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng);10日齡SPF雞胚購(gòu)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院國(guó)家水禽基因庫(kù);pET-32a載體、大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 酶和相關(guān)試劑

Trizol試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司;T4 DNA連接酶、BamHⅠ和XhoⅠ購(gòu)于Fermentas公司;His標(biāo)簽單抗、HRP-羊抗鼠IgG、質(zhì)粒小提試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于康為世紀(jì)公司;DNA膠回收試劑盒購(gòu)于愛(ài)思進(jìn)公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的DHAV-ⅠSH株病毒基因組序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)VP0基因序列的一對(duì)引物，為了便于基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建等后繼工作，上游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為:VP0-F/R:GATACTCTTACTAAAAAC-3’(下劃線為 BamHⅠ酶切位點(diǎn))GTCGGGG-3’(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.4 DHAV-1的增殖與病毒RNA的提取

取10倍稀釋的原代病毒0.2 mL接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，于37℃孵化箱孵化。選擇48～72 h之內(nèi)死亡的雞胚，置于4℃過(guò)夜，收集尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液總RNA，操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.5 DHAV-1VP0擴(kuò)增和測(cè)序

根據(jù)Invitrogen公司的RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，反應(yīng)程序設(shè)定為:25℃，10 min;42℃，90 min;70℃，10 min。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;然后95℃ 30 s，52℃，30 s;72℃，1 min，30個(gè)循環(huán);再72℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 重組質(zhì)粒載體pET-VP0的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離回收純化，然后經(jīng)BamHⅠ，XhoⅠ酶切后，與經(jīng)同樣酶切的pET-32a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單菌落，提取質(zhì)粒電泳篩選，并進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確后送由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pET-VP0。

1.7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒 pET-VP0轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21(DE3)，挑取單菌落接種于5 mL含氨芐青霉素(Amp)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1% 接種量轉(zhuǎn)接至含Amp的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液 OD600值達(dá) 0.4～0.6之間時(shí)，加入 IPTG至終濃度在0.2 ～1.0 mmol·L-1，37 ℃ 誘導(dǎo)3 ～5 h，離心收集菌體，溶于適量PBS中，超聲波裂解菌體，離心后分別收集上清液及沉淀，于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谙嗤瑮l件下誘導(dǎo)含表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a的空載體及未加誘導(dǎo)劑的受體菌作為空白和陰性對(duì)照。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

誘導(dǎo)后，取200 μL的菌液與50 μL的5×SDS上樣緩沖液混勻后，沸水煮沸3 min，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳分析。將誘導(dǎo)樣品和非誘導(dǎo)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，以鼠抗His單抗作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.9 重組蛋白抗血清的制備

將重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，經(jīng)1 mol·L-1KCl染色，切出目的條帶，加入少量PBS研磨勻漿化，以皮下兩點(diǎn)注射法免疫6周齡ICR小鼠，每隔2周免疫1次，4次免疫后第14天采血，分離血清，至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 多抗血清的Western-blotting鑒定

將DHAV-1 SH毒株雞胚尿囊液進(jìn)行SDSPAGE，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，以制備的鼠多抗血清作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。同時(shí)以未接種DHV雞胚尿囊液作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP0基因的克隆

以提取的尿囊液總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出約800 bp的目的條帶，與預(yù)期相符?；厥蘸笥肂amHⅠ，XhoⅠ酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-32a連接，獲得的陽(yáng)性克隆命名為pET-VP0，經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后獲得約800 bp和5 900 bp 2個(gè)條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，且進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果表明，克隆的VP0基因序列及閱讀框完全正確。

圖1 重組質(zhì)粒pET-VP0的酶切鑒定Fig.1 Identification of pET-VP0 by restriction endonucleases digestion

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

將pET-VP0重組菌用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并用pET-32a載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)宿主菌同時(shí)誘導(dǎo)作為對(duì)照。結(jié)果表明，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，37℃誘導(dǎo)4～5 h，重組蛋白可以得到較高水平的表達(dá)，并均以包涵體形式存在。重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為48 kD(圖2)，與理論值相符。以抗His標(biāo)簽單抗對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果在目的位置出現(xiàn)1條特異條帶(圖3)。

圖2 VP0重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of VP0 recombinant protein

圖3 VP0重組蛋白的Western blotting鑒定Fig.3 Western blotting identification of VP0 recombinant protein

2.3 多抗血清的Western-blotting鑒定

以純化的融合蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物免疫ICR小鼠，制備VP0蛋白的多抗血清，獲得的血清能與DHAV-1 SH毒株雞胚尿囊液反應(yīng)，條帶大小約為28 kD(圖4)，為VP0蛋白大小。

圖4 VP0多抗血清的Western-blotting鑒定Fig.4 Western-blotting identification of VP0 antiserum

3 討論

DHAV屬于小RNA病毒，其衣殼由3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP0，VP3和VP1組成，其中VP0、VP1大部分暴露在病毒粒子表面，具有很強(qiáng)的抗原性和宿主保護(hù)位點(diǎn)。不同DHAV血清型之間VP1基因變化較大，而VP0則相對(duì)保守［10］。根據(jù)親緣關(guān)系最近的人雙埃柯病毒的研究，推測(cè)DHAV-1結(jié)構(gòu)蛋白VP0上可能存在保守的B細(xì)胞表位［6］，所以，利用結(jié)構(gòu)蛋白VP0為包被抗原建立DHAV的ELISA檢測(cè)方法，可以廣泛的識(shí)別各株DHAV-1產(chǎn)生的血清抗體，將具有廣發(fā)的應(yīng)用前景。

相對(duì)于病毒純化來(lái)說(shuō)，利用成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)，更容易得到相對(duì)簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)蛋白。pET表達(dá)系統(tǒng)是目前使用較為廣泛的一種原核表達(dá)系統(tǒng)，在誘導(dǎo)狀態(tài)下宿主菌內(nèi)幾乎所有的資源都可以轉(zhuǎn)向目的基因的表達(dá)，外源基因的表達(dá)量一般可以達(dá)到菌體總蛋白的30%以上。表達(dá)的融合蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，方便目的蛋白的純化，其腸激酶酶切位點(diǎn)可切除去融合部分，利用目的蛋白的研究。本試驗(yàn)用pET-32a表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了DHAV-1 VP0蛋白，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出完整的VP0基因，序列分析表達(dá)克隆的 VP0基因長(zhǎng)為 768 bp，與DHAV-ⅠSH株序列同源性達(dá)100%，SDS-PAGE電泳和Western-blotting分析證明表達(dá)的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為48kD。

盡管pET原核系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白缺少翻譯后加工功能，但表達(dá)產(chǎn)物依舊保持了良好的免疫原性。本試驗(yàn)利用表達(dá)的融合蛋白免疫小鼠制備了針對(duì)重組蛋白的多抗血清，Western-blotting分析說(shuō)明制備的多抗血清可與DHAV尿囊液中的VP0蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，充分說(shuō)明制備的多抗血清具有很好的特異性，可以作為檢測(cè)用抗體進(jìn)一步用于DHAV VP0抗原的檢測(cè)及功能研究。

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