洪玉鋒，張 熊

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦二科，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 咸陽 712000）

Ezrin和p16基因在宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位組織中的表達(dá)及其臨床意義

洪玉鋒1，張 熊2

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦二科，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 咸陽 712000）

目的探討埃茲蛋白(Ezrin)和p16基因在宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)39例宮頸癌患者和35例宮頸柱狀上皮異位患者組織Ezrin mRNA和p16 mRNA的表達(dá)，并選取正常宮頸組織作為對(duì)照組，比較分析以上指標(biāo)的變化。結(jié)果Ezrin mRNA和p16 mRNA在宮頸癌組、宮頸柱狀上皮異位組及對(duì)照組中的表達(dá)率分別為89.7%、22.8%、21.0%和94.8%、22.8%、5.2%。Ezrin mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)率顯著高于宮頸柱狀上皮異位組及對(duì)照組(P＜0.01)，在宮頸柱狀上皮異位與對(duì)照組中Ezrin mRNA表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。p16 mRNA在宮頸癌與宮頸柱狀上皮異位組織中的表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，在宮頸癌組織的表達(dá)率高于宮頸柱狀上皮異位組織，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Ezrin mRNA和p16 mRNA分別在宮頸癌組、宮頸柱狀上皮異位組及對(duì)照組中的表達(dá)量分別為(0.82±0.17)、(0.25±0.06)、(0.23±0.07)和(0.77±0.12)、(0.35±0.07)、(0.22±0.05)。Ezrin mRNA和p16 mRNA在宮頸癌組中的表達(dá)量具有相關(guān)性(r=0.539，P＜0.01)。結(jié)論檢測(cè)組織Ezrin和p16基因表達(dá)可應(yīng)用于宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位的鑒別診斷，并為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

埃茲蛋白；基因p16；宮頸癌；宮頸柱狀上皮異位

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，宮頸癌和癌前病變的早期發(fā)現(xiàn)及治療，可降低該病的發(fā)病率和死亡率。宮頸柱狀上皮異位過去稱為宮頸糜爛，早期宮頸癌常無明顯癥狀和體征，宮頸可光滑，難以與宮頸柱狀上皮異位區(qū)別，容易造成漏診或誤診[1]。有研究認(rèn)為，埃茲蛋白(Ezrin)和p16基因在多種腫瘤組織中存在過度表達(dá)[2-3]，近年來出現(xiàn)了Ezrin和p16基因與宮頸癌相關(guān)的報(bào)道[4-5]，Ezrin在宮頸柱狀上皮異位組織中少見報(bào)道。本研究通過實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位患者組織Ezrin與p16基因的表達(dá)，探討兩種標(biāo)志物與相關(guān)病理因素間的關(guān)系，旨在為上述兩種疾病的鑒別診斷提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2014年10月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的宮頸病變組織標(biāo)本共112例，分成三組，其中宮頸癌組39例，宮頸柱狀上皮異位組35例，正常宮頸組織(對(duì)照組)38例。宮頸癌組年齡27～63歲，平均43.7歲；按照2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)分期，其中IB1期12例，IB2期7例，ⅡA期11例，ⅡB期9例；高中分化25例，低分化14例；無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；高危型HPV16/18陰性6例，陽性32例，1例遺漏未做。宮頸柱狀上皮異位組年齡18～53歲，平均35.1歲，其中單純型11例，顆粒型11例，乳突型13例；該組患者就診時(shí)均有性生活史(未婚或已婚)，近期未接受其他有關(guān)治療，陰道清潔度為Ⅰ～Ⅱ度。對(duì)照組年齡20～59歲，平均40.7歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究標(biāo)本的收集均獲得患者知情同意，所有標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師再次閱片復(fù)診。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 方法、儀器和試劑 采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)研究宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位患者組織Ezrin mRNA與p16 mRNA表達(dá)狀況。RNA提取采用美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。lightCycler熒光PCR儀使用德國(guó)Roche公司產(chǎn)品。PCR試劑盒采用上海久盛醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品。

1.2.2 總RNA的提取 采用Trizol法提取組織中的總RNA，在分光光度計(jì)上檢測(cè)A260/280的比值以驗(yàn)證RNA的純度。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，Ezrin mRNA的引物序列為：正義鏈5'-GATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT-3'，反義鏈5'-GGGGCGGGG GTGCTGTCAT-3'；產(chǎn)物長(zhǎng)度700 bp。p16的引物序列為：正義鏈5'-AGCCTTCGGCTGACTCGCTGGTCA-3'，反義鏈5'-CTGCCCATCATGACCTGGCCTAAG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度650 bp。β-actin作為內(nèi)參照，引物序列為：正義鏈5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'，反義鏈5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度350 bp。反應(yīng)條件：94℃3min→94℃60 s，58℃60 s，72℃1.5min，40個(gè)循環(huán)→72℃15min→4℃保存。

1.2.4 基因片段序列測(cè)定和分析 使用測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果通過BLAST應(yīng)用軟件與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.5 標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)量計(jì)算 對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行凝膠電泳，通過紫外光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并記錄，用四維成像處理系統(tǒng)，測(cè)定各組的cDNA的特異性，miRNA表達(dá)量用Ct值的變化(△Ct)表示?！鰿t=宮頸癌組或?qū)m頸柱狀上皮異位組Ct均值-對(duì)照組Ct均值。由2-△ct得出相應(yīng)的miRNA的相對(duì)表達(dá)量。組織Ezrin mRNA和p16 mRNA電泳圖見圖1、圖2。

圖1 不同病變組織p16 mRNA表達(dá)

圖2 不同病變組織Ezrin mRNA表達(dá)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評(píng)價(jià)組織Ezrin mRNA和p16 mRNA在診斷宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位疾病中的作用，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組受試者組織Ezrin mRNA和p16 mRNA表達(dá)率比較 Ezrin mRNA在宮頸癌組、宮頸柱狀上皮異位組及對(duì)照組中的表達(dá)率分別為35/39(89.7%)、8/35(22.8%)、8/38(21.0%)；p16 mRNA在上述三組中的表達(dá)率分別為37/39(94.8%)、8/35(22.8%)、2/38 (5.2%)。Ezrin mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)率明顯高于其他兩組(χ2=33.90、36.82，P＜0.01)，在宮頸柱狀上皮異位與對(duì)照組中Ezrin mRNA表達(dá)率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.035，P＞0.05)。p16 mRNA在宮頸癌與宮頸柱狀上皮異位組織中的表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(χ2=61.80、4.77，P＜0.01、P＜0.05)，在宮頸癌組織的表達(dá)率高于宮頸柱狀上皮異位組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=40.17，P＜0.01)。

2.2 三組受試者組織Ezrin mRNA和p16 mRNA表達(dá)量比較 Ezrin mRNA在宮頸癌組、宮頸柱狀上皮異位組及對(duì)照組中的表達(dá)量分別為(0.82±0.17)、(0.25±0.06)、(0.23±0.07)；p16 mRNA在上述三組中的表達(dá)量分別為(0.77±0.12)、(0.35±0.07)、(0.22±0.05)。Ezrin mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯高于其他兩組(t=41.18、42.60，P＜0.01)，宮頸柱狀上皮異位與對(duì)照組中的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.58，P＞0.05)。p16 mRNA在宮頸癌與宮頸柱狀上皮異位組織中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(t=46.75、21.87，P＜0.01)，宮頸癌組織中的表達(dá)量高于宮頸柱狀上皮異位組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.28，P＜0.01)。

2.3 Ezrin mRNA和p16 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性 Ezrin mRNA和p16 mRNA在宮頸癌組中的表達(dá)量具有正相關(guān)性(r=0.539，P＜0.01)。

2.4 ROC曲線分析 宮頸癌組以宮頸柱狀上皮異位組為參照，Ezrin mRNA和p16 mRNA表達(dá)量的AUC分別為0.719、0.682(P＜0.01)，聯(lián)合檢測(cè)Ezrin mRNA和p16 mRNA的AUC為0.853(P＜0.01)，單獨(dú)檢測(cè)組織Ezrin mRNA和p16 mRNA表達(dá)量分別用于診斷宮頸柱狀上皮異位時(shí)，以對(duì)照組為參照的AUC分別為 0.307，P＞0.05；0.607，P＜0.01。組織Ezrin mRNA和p16 mRNAROC曲線見圖3～圖5。

圖3 聯(lián)合檢測(cè)兩標(biāo)志物ROC曲線；

圖4 宮頸癌組單獨(dú)檢測(cè)兩標(biāo)志物ROC曲線;

圖5 宮頸柱狀上皮異位組單獨(dú)檢測(cè)兩標(biāo)志物ROC曲線

3 討論

近年來研究認(rèn)為Ezrin在多種腫瘤組織中過度表達(dá)，在婦科腫瘤、胰腺癌、乳腺癌中，其高表達(dá)均已被證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。Ezrin蛋白與腫瘤細(xì)胞表面直接接觸后作用于其表面的粘附因子，進(jìn)一步影響腫瘤的分化、侵襲性和轉(zhuǎn)移[6]。有研究發(fā)現(xiàn)Ezrin、IL-6和MMP-9在子宮頸浸潤(rùn)性鱗癌中的過度表達(dá)與子宮頸鱗癌的侵襲行為有關(guān)，其可作為判斷子宮頸鱗癌的早期診斷指標(biāo)[7]。本研究顯示，Ezrin在宮頸癌組織中表達(dá)高于宮頸柱狀上皮異位組織及正常宮頸組織(P＜0.01)，在宮頸柱狀上皮異位組織與及正常宮頸組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示Ezrin蛋白與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其可作為鑒別宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位的一項(xiàng)重要的標(biāo)志物。

p16基因是一種抑癌基因，其與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)系，因此也被稱為腫瘤抑制基因。但在宮頸癌組織中p16基因呈現(xiàn)過度表達(dá)[3]，其與腫瘤的侵襲性及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-9]，可作為檢測(cè)宮頸癌及其癌前病變的一個(gè)有效的標(biāo)志物[10]。本研究顯示，p16基因在宮頸癌組織和宮頸柱狀上皮異位組織中表達(dá)高于正常宮頸組織(P＜0.01)，在宮頸癌組織的表達(dá)又高于宮頸柱狀上皮異位組織(P＜0.01)。推測(cè)p16基因在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起到非常重要的作用，可以作為鑒別宮頸癌前病變和宮頸柱狀上皮異位的分子標(biāo)記物。

Ezrin mRNA和p16 mRNA在宮頸癌組中的表達(dá)量具有正相關(guān)性，顯示兩標(biāo)志物與宮頸癌的病變發(fā)展密切相關(guān)。利用ROC曲線評(píng)價(jià)兩標(biāo)志物的結(jié)果顯示，組織Ezrin和p16基因在鑒別宮頸癌與宮頸柱狀上皮異位疾病中有診斷意義(P＜0.01)。單獨(dú)檢測(cè)組織p16基因?qū)υ\斷宮頸柱狀上皮異位有意義(P＜0.01)，而單獨(dú)檢測(cè)Ezrin對(duì)宮頸柱狀上皮異位無獨(dú)立的診斷意義(P＞0.05)。

綜上所述，組織Ezrin和p16基因的檢測(cè)可應(yīng)用于宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位的鑒別診斷，并為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

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Expression and clinical significance of Ezrin and p16 in tissues of cervical cancer and cervical columnar epithelium ectopy.

HONG Yu-feng1,ZHANG Xiong2.1.The Second Departerment of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Xianyang City,Xianyang 712000,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of Ezrin and p16 in tissues for cervical cancer and cervical columnar epithelium ectopy.MethodsThe expression of Ezrin mRNA and p16 mRNA were detected with the polymerase reaction technology in the tissues of 39 patients with cervical cancer(group A)and 35 patients with cervical columnar epithelium ectopy(group B).Normal cervical tissues were selected as the control group.The changes of above indicators were compared.ResultsThe expression rates of Ezrin mRNA and p16 mRNA in group A,group B and the control group were 89.7%,22.8%,21.0%and 94.8%,22.8%,5.2%,respectively. The expression rates of Ezrin mRNA in group A was significantly higher than the other two groups(P＜0.01),which showed no statistsically significantly differnece between group B and the control group(P＞0.05).The expression rates of p16 mRNA in group A and group B were signifiantly higher than that in the control group(P＜0.01),and that in group A was higher than that in group B(P＜0.01).The expression quantities of Ezrin mRNA and p16 mRNA in group A,group B, the control group were(0.82±0.17),(0.25±0.06),(0.23±0.07)and(0.77±0.12),(0.35±0.07),(0.22±0.05),respectively.Expression of Ezrin mRNA and p16 mRNA were corelated in group A(r=0.539,P＜0.01).ConclusionTesting the expression of Ezrin and p16 in tissues can be used in the differential diagnosis between cervical cancer and cervical columnar epithelium ectopy,which provides basis for the early discovery of cervical cancer.

Ezrin;p16;Cervical cancer;Cervical columnar epithelium ectopy

R737.33

A

1003—6350（2015）21—3127—04

2015-03-12)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.21.1138

張 熊。E-mail：418079040@qq.com