黎 雯，牛 牧，黃瑞葉

(海南省皮膚病醫(yī)院皮膚外科，海南 ?？?570206)

甘草提取物對人表皮黑素細(xì)胞遷移及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響

黎 雯，牛 牧，黃瑞葉

(海南省皮膚病醫(yī)院皮膚外科，海南 ?？?570206)

目的 探討甘草提取物對體外培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞遷移和細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。方法從健康人包皮組織分離、培養(yǎng)黑素細(xì)胞，用甘草提取物處理黑素細(xì)胞，對照組僅加入等量培養(yǎng)基，采用Transwell微孔膜法研究黑素細(xì)胞遷移，采用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測鈣離子。結(jié)果當(dāng)甘草提取物在濃度＞1.25 mg/L時(shí)，其黑素細(xì)胞遷移數(shù)目與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)濃度下的甘草提取物經(jīng)處理后均能降低人黑素細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平；不同濃度甘草提取物對黑素細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論推測甘草提取物可能通過降低黑素細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度從而抑制進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移。

黑素細(xì)胞；甘草提取物；遷移；鈣離子

甘草是中醫(yī)治療中較為常用的藥物，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為甘草具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效。西方醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)甘草具有抗炎、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)和美白的作用[1]。甘草的化學(xué)成分較為復(fù)雜，現(xiàn)在已從甘草中分離出的較多化合物，但其中主要成分為甘草甜素、甘草次酸。近年來有研究提示甘草有抑制黑素細(xì)胞酪氨酸酶和黑素瘤細(xì)胞黑素合成的作用[2]。為深入研究甘草對人表皮黑素細(xì)胞的調(diào)控作用，筆者首先體外分離、培養(yǎng)正常人表皮黑素細(xì)胞，然后采用不同濃度的甘草提取物處理黑素細(xì)胞，觀察黑素細(xì)胞增殖情況，通過檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，以探討甘草提取物對其可能的作用機(jī)制，為化妝品及藥物的研發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 甘草提取物采購自中國藥品生物制品所。先用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成濃度100 g/L母液，置于-20℃冰箱低溫保存，實(shí)驗(yàn)過程中用新鮮培養(yǎng)基調(diào)至終濃度。

1.2 主要試劑的配制 M254培養(yǎng)基、人黑素細(xì)胞生長添加劑HMGS購自美國Cascade公司；MTS購自美國Promega公司；青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；DMSO購于美國Sigma公司；Dispase分離酶購自美國羅氏試劑公司；

1.3 細(xì)胞來源 健康人表皮黑素細(xì)胞，來源于6～18歲青少年男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮組織，由海南省皮膚病醫(yī)院皮膚外科門診手術(shù)室提供?；颊咭阎橥?。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 分別設(shè)定甘草提取物濃度為1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L，對照組僅加入等量培養(yǎng)基，其甘草提取物濃度為0。

1.4.2 分離人表皮黑素細(xì)胞 首先將包皮組織放在75%的酒精中浸泡約10 min，拿出后用磷酸鹽緩沖液(PBS)液沖洗5～8次；使用眼科剪剔除脂肪組織，再用PBS液沖洗5～6次；將組織剪為1.5 mm×1.5 mm的組織塊，置于培養(yǎng)皿中；加入Dispase酶5 ml，置于4℃冰箱中16 h，后移入培養(yǎng)箱孵育1 h；然后剪去真皮，留下表皮。再使用PBS沖洗組織2～3次，常溫下0.25%胰蛋白酶消化5 min，最后加入FBS終止。玻璃管吹打組織，制成人表皮黑素細(xì)胞懸液，后用200目細(xì)胞篩過濾，低速離心(1 200 r/min)3 min后細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，接種于無菌培養(yǎng)瓶中，每瓶加入M254完全培養(yǎng)基4 ml，隨后置于37℃的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后可給予首次換液，以后每隔2～3 d換液1次，方法同文獻(xiàn)[3]。

1.4.3 人表皮黑素細(xì)胞的鑒定(L-DOPA染色法) 取第三代人表皮黑素細(xì)胞，消化后調(diào)整黑素細(xì)胞濃度至1×104/ml，接種在6孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。后加入已預(yù)熱至37℃的4%多聚甲醛固定細(xì)胞25 min，雙蒸水沖洗3次。將細(xì)胞蓋玻片轉(zhuǎn)移至L-DOPA染色液中浸泡，每隔30 min觀察染色情況，約3 h后染液呈棕色，漂洗蓋玻片，復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精逐級脫水，最后二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.4.4 不同濃度甘草提取物對人表皮黑素細(xì)胞遷移的影響 選取孔洞直徑為8.0 μm的聚碳酸酯膜Transwell小室。把纖連蛋白(FN)用培養(yǎng)基稀釋至20 μg/ml，室溫下Transwell小室底面包被。黑素細(xì)胞消化后重懸于含0.1%FBS的M254培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml。然后在每個(gè)Transwell上室加入100 μl；下室內(nèi)分別加入濃度為1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L的甘草提取物完全培養(yǎng)液500 μl，另設(shè)對照組，僅添加完全培養(yǎng)基。每孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后取出Transwell小室，用棉簽拭去上層小室的細(xì)胞，甲醛將下室面的黑色細(xì)胞固定25 min，將聚碳酸酯膜用刀片切下，用蘇木精染色10 min，每張膜在高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，觀察并計(jì)算移行的黑素細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，方法參考文獻(xiàn)[4]。

1.4.5 人表皮黑素細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定 消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml，接種于中央打孔的培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基500 μl，另設(shè)對照組，僅添加完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，分別給予1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L甘草提取物完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，后用PBS沖洗，于37℃用10 μmol/L Fluo-3/AM負(fù)載30 min，PBS沖洗，置于激光共聚焦顯微鏡載物臺，Bio-Rad激光共聚焦軟件，動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度改變(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人表皮黑素細(xì)胞鑒定結(jié)果 經(jīng)左旋多巴染色后，鏡下可見人表皮黑素細(xì)胞樹突及胞漿呈黑色或棕褐色，此為陽性反應(yīng)，證明為黑素細(xì)胞，見圖1。

圖1 L-DOPA染色陽性人表皮黑素細(xì)胞(×200）

2.2 甘草提取物對人表皮黑素細(xì)胞遷移的影響 甘草提取物在濃度為1.25 mg/L時(shí)黑素細(xì)胞遷移與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但當(dāng)濃度為2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L時(shí)黑素細(xì)胞遷移與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 甘草提取物對黑素細(xì)胞遷移的影響(±s)

表1 甘草提取物對黑素細(xì)胞遷移的影響(±s)

甘草提取物濃度(mg/L) 0(對照組) 1.25 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0人表皮黑素細(xì)胞遷移數(shù)28.667±3.750 28.583±2.282 25.367±2.433 25.403±2.518 25.667±1.986 23.167±3.033 22.235±4.122 t值(與對照組比較) P值(與對照組比較) 0.057 4 2.164 2 2.214 7 2.167 8 2.120 9 3.421 1 0.954 9 0.043 6 0.041 6 0.045 6 0.049 9 0.003 5

2.3 甘草提取物對人表皮黑素細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響 實(shí)驗(yàn)濃度下甘草提取物處理后均能降低人黑素細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平；不同濃度甘草提取物與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度甘草提取物對體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響

3 討論

黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，其分化發(fā)育歷經(jīng)3個(gè)階段：自胚胎發(fā)育2～5周時(shí)期開始，在細(xì)胞表面受體家族整合素的作用下，神經(jīng)嵴細(xì)胞不斷地發(fā)生遷移，在此過程中可轉(zhuǎn)化為成黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞并移行其適宜的生存環(huán)境-表皮基底層及毛囊。黃褐斑、雀斑以及日光性損傷等色素障礙性皮膚病由于黑素顆粒過多聚集引起。黑素細(xì)胞的遷移在其發(fā)病中其重要作用。細(xì)胞遷移對胚胎發(fā)育、傷口愈合、白細(xì)胞吞噬、惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義[5]。甘草的化學(xué)組成較為復(fù)雜，目前為止從甘草中分離出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、異甘草甙、新甘草甙等數(shù)十種化合物，但其中的主要成分為甘草甜素和甘草次酸。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰、調(diào)和諸藥的功效。西方醫(yī)學(xué)認(rèn)為甘草還具有抗炎、殺菌和美白、抗氧化和清除自由基作用。有研究發(fā)現(xiàn)甘草有抑制黑素細(xì)胞酪氨酸酶和黑素瘤細(xì)胞黑素合成的作用。本研究用目前常用的Transwell微孔濾膜法檢測體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞遷移，研究表明：甘草提取物在濃度為1.25 mg/L時(shí)黑素細(xì)胞遷移與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但當(dāng)濃度為2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L時(shí)黑素細(xì)胞遷移與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但濃度繼續(xù)增大對于黑素細(xì)胞的影響，我們目前的實(shí)驗(yàn)未涉及，我們將在今后的試驗(yàn)中擴(kuò)大甘草提取物濃度范圍，以全面、系統(tǒng)地分析其對黑素細(xì)胞調(diào)控作用。

在細(xì)胞中，鈣是重要的第二信使，通過其可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移活動(dòng)[6]。本實(shí)驗(yàn)通過激光共聚焦系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度的變化，研究甘草提取物對黑素細(xì)胞遷移及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響。通過激光共聚焦顯微鏡，可觀察亞細(xì)胞水平上Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化。研究結(jié)果提示：實(shí)驗(yàn)濃度下甘草提取物處理后均能降低人黑素細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平；不同濃度甘草提取物與對照組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯示甘草提取物可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的降低，推測可能是甘草提取物某些成分可組織鈣離子與細(xì)胞胞膜受體結(jié)合后激活磷脂酶C(PLC)，進(jìn)而減少PLC分解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸生成二酯酰甘油(DAG)、肌醇-1，4，5三磷酸(IP3)的能力。減少IP3與受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)儲存的Ca2+釋放減少。

本研究未發(fā)現(xiàn)較高濃度的甘草有細(xì)胞毒性作用。通過以上數(shù)據(jù)我們推測甘草提取物中某些成分可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低從而抑制黑素細(xì)胞遷移，為化妝品及藥物的研發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

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Effects of licorice extract on migration and[Ca2+]i in human melanocytes in vitro.

LI Wen,NIU Mu,HUANG Rui-ye.
Department of Dermatologic Surgery,Hainan Provincial Center for Skin Disease and STI Control,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of licorice extract on migration and[Ca2+]i in human melanocytes in vitro．MethodsHuman melanocytes,obtained from normal foreskins,were treated with licorice(the study group)and equivalent medium(the control group).Cell migration was assessed using the transwell micropore filter method,and[Ca2+]i was detected by confocal laser scanning microscope.ResultsWhen the concentration of licorice extract was higher than 1.25 mg/L,the migration number of melanocyte was statistically significantly different from that of the control group(P＜0.05).After treatment with the experimental concentration of licorice extract,[Ca2+]i levels in the human melanocytes were significantly reduced.The effect of different concentrations of licorice extract on [Ca2+]i showed statistically significant difference with that of the control group(P＜0.05).ConclusionLicorice extract inhibite the melanocyte migration through reducing the concentration of[Ca2+]i.

Melanocyte;Licorice extract;Migration;[Ca2+]i

R284.2

A

1003—6350（2015）13—1876—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.13.0676

2015-01-21)

黎 雯。E-mail：lw1025325@163.com